低剂量电离辐射生物诱变方法及应用和植物育种方法与流程

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种低剂量电离辐射生物诱变方法及应用和植物育种方法。

背景技术：

通常的辐射诱变，是利用χ、γ、α、β射线和中子、紫外光等辐射处理生物体，诱发遗传物质的改变，使后代出现新的变异类型。在植物诱变中，一般采用60Co-γ射线对植物种子进行处理，所采用的剂量通常为50-300Gy，根据不同植物种类或品种，适宜的辐射剂量有所不同。其主要特征是，(1)诱导产生新的基因序列变异；(2)辐射剂量大；(3)变异方向不可控，多数为劣变；(4)致死率高。

目前农业育种(包括工业微生物菌种)中常用的育种材料，包括一般品种、亲本、自交系和自然种，虽然通过多代筛选，在表型上已经具有很高的一致性，但是群体内都存在着大量的隐匿性遗传变异(遗传多样性)，这些变异来自于长期的自然突变。基于最新提出的遗传缓冲理论，在生物群体中，多数性状都存在大量的隐匿性遗传变异，在正常条件下，遗传缓冲阻止了这些遗传变异的表达，保证生物发育和表型的稳定性，当发生某些环境胁迫或其他变化时，遗传缓冲被抑制或干扰，正常发育被破坏，生物中隐藏的遗传变异得到表达，产生了新的表型变异。

目前，尚未有利用该理论进行生物诱变或植物育种的应用方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新型的生物诱变方法及应用和植物育种方法。本发明的方法利用群体中积累的隐匿性变异，不产生新的遗传变异；变异频率高；可产生有利或综合性的变异性状；通过筛选富集变异可稳定遗传。并且简便、可大批量进行；辐射剂量小，不会对植物正常生长产生显著影响，便于变异筛选。

本发明的第一方面是提供一种低剂量电离辐射生物诱变方法，该方法包括：利用低剂量电离辐射处理休眠态生物体，使其发生表型变异。根据本发明，所述低剂量电离辐射只要能实现休眠态生物体的表型变异即可。优选地，所述低剂量电离辐射的剂量为1Gy以下。进一步优选为5-200mGy。

根据本发明，优选地，所述低剂量电离辐射的剂量率为100mGy/天以下，进一步优选为10mGy/天以下，可长时间连续或间断处理。

本发明的原理基于此：Hsp90是一种分子伴侣，其在生物的遗传缓冲中起着核心作用。Hsp90遗传缓冲抑制了这些变异的表达并积累变异。利用低剂量电离辐射干扰Hsp90基因表达和遗传缓冲，生物群体中会产生各种表型变异，由于这些变异多数是由许多微小变异控制的，可以通过筛选和杂交将其富集，成为稳定遗传性状。

Hsp90家族非常保守，在动物、植物、真菌和细菌中都已发现Hsp90的同源基因。因此，根据本发明，所述休眠态生物体可以为生长和代谢处于暂时停顿状态的任何生物体，优选为植物种子或其他植物繁殖体、微生物孢子和动物卵中的至少一种。所述植物种子可以为植物干种子或湿种子。所述其他植物繁殖体优选包括：用于繁殖的球茎、块茎、块根、根茎、休眠的接穗或芽；花粉粒；或者，植物组织培养的外植体、化药、小孢子、体细胞组织、悬浮细胞系或原生质体。其中，所述植物种子例如为拟南芥种子，所述微生物孢子例如为细菌芽孢，所述动物卵例如为果蝇卵。

本发明的第二方面是提供上述生物诱变方法在生物育种中的应用。

其中，本发明的所述生物可以包括植物、卵生动物或微生物。

本发明的第三方面是提供一种植物育种的方法，该方法包括：

(1)根据上述方法对植物种子或其他植物繁殖体进行生物诱变，得到表型变异体；

(2)筛选并杂交所述表型变异体，使其遗传性状稳定。上述杂交的方法可以为本领域常规的杂交方法。

根据本发明，通过低剂量电离辐射可能同时获得多种不同变异的表型变异体。因此，筛选同种表型变异体进行杂交。

本发明中，所述植物种子可以为植物干种子或湿种子。所述其他植物繁殖体优选包括：用于繁殖的球茎、块茎、块根、根茎、休眠的接穗或芽；花粉粒；或者，植物组织培养的外植体、化药、小孢子、体细胞组织、悬浮细胞系或原生质体。

优选地，所述植物种子为干种子，进一步优选为拟南芥干种子。

根据本发明，所述电磁辐射可以为本领域常规的射线辐射，包括但不限于χ、γ、α、β射线、中子、紫外光。

目前已知抑制Hsp90基因功能的方法有：热激、抑制剂、基因工程方法。其中，热激是将动物、植物、微生物在较高的温度下进行培养，使之处于热激胁迫，细胞内大量蛋白变性，从而造成Hsp90分子伴侣的相对短缺；抑制剂，是将Hsp90蛋白的特异性抑制剂格尔德霉素加入到动物的食物或植物的培养基中；基因工程方法是通过基因突变或转基因对Hsp90基因序列进行突变或对其表达进行抑制。以上三种方法进行诱变处理时，都存在较大的局限性，其中，热激胁迫会对动、植物的生长产生严重影响，导致生长不良；抑制剂格尔德霉素见光易分解(48小时内)，只能对植物进行短期避光处理；基因工程方法难度较高，费时费力，不便于应用。

与常规辐射诱变和已知抑制Hsp90功能方法比较，本发明进行低剂量辐射处理方法的优势包括：

(1)利用群体中积累的隐匿性变异，不产生新的遗传变异。

(2)变异频率高。

(3)群体内积累的变异，多数已经过筛选，剩下的多为微效或有利变异，通过富集可产生有利或综合性的变异性状。

(4)方法简便，可大批量进行。仅需对种子进行低剂量γ辐照处理，后续无需特殊培养条件即可诱导变异，一次可处理大量不同种类、品种的种子。

(5)辐射剂量小，不会对植物正常生长产生显著影响，便于变异观察。本发明所用辐射剂量约为通常辐射育种所用剂量的几千-几十万分之一。处理后，植物的正常生长不会受到显著影响，仅有少数植株会发生一些形态变异，非常方便观察与筛选。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1显示的是Greenville生态型拟南芥低剂量辐射诱导突变体。

图2显示的是Col-PRL生态型拟南芥低剂量辐射诱导突变体。

具体实施方式

一、植物低剂量辐射诱变及选育方法

1、诱变材料的选择

诱变材料的选择是低剂量辐射诱变育种能否成功的关键之一，应根据育种目标，选择综合性状优良、稳定、一致的品种作为诱变材料，它们可以是推广品种、地方品种、野生种、自交系、杂交种的亲本、甚至杂交种。所选品种材料已具有育种目标所要求的大部分性状，仅需改良某些方面的性状，例如：提高产量、改良品质、增强抗性等。所选材料应具有通过有性杂交繁殖后代的能力。用于诱变的材料可以是干种子、湿种子；也可以是用于繁殖的休眠态营养体，如球茎、块茎、块根、根茎等；休眠的接穗或芽；花粉粒；以及植物组织培养的外植体、化药、小孢子、体细胞组织、悬浮细胞系和原生质体等，优选为植物干种子。

2、低剂量辐射诱变

选取一定数量的上述植物材料，优选地，每种材料的数量大于1000个。利用χ、γ、α、β射线和中子、紫外光对所选材料进行辐照处理，优选地，使用60Co-γ射线进行辐照处理。辐照的总剂量小于1Gy，优选地，总剂量小于200mGy，大于5mGy。辐照处理可以长时间连续或间断进行，每天辐照剂量小于100mGy，优选地，每天辐照剂量小于10mGy，辐照周期大于5天，优选地，辐照周期大于10天。辐射处理后可以立即进行萌发，也可低温储藏一定时间后再进行萌发，优选为30天以内。

3、变异的选育

低剂量辐射诱变当代即可表现突变性状。在辐照当代，从幼苗期开始，筛选植株形态、发育、果实等各种性状变异，并按性状的相似性对变异株进行分类。根据育种目标挑选感兴趣的变异株进行自交留种，或与性状相近的变异株进行杂交留种。在自交和杂交后代中选取目标性状突出的变异株，再进行自交和杂交留种。重复进行几代后即可获得具有稳定性状的突变体。

多数变异株的前几代自交或杂交后代群体，表现父代变异性状的频率较低，通过自交或杂交可以使变异性状表现频率逐渐升高。一般经过3-5代自交或杂交即可获得具有较高表现率的性状稳定的突变群体。

二、微生物孢子低剂量辐射诱变方法

1、诱变材料的选择

用于诱变的微生物可以是用于工业、农业、林业、医学、药用等各种行业的微生物菌种，诱变的材料可以是真菌的孢子或细菌的芽孢。

2、低剂量辐射诱变

辐照的剂量与方法与植物低剂量辐射诱变方法相同。

3、突变体筛选

将辐照过的菌种，在通用或筛选培养基上进行培养，通过对菌落形态的观察、染色鉴定以及生理生化试验，筛选变异菌株，再通过分离纯化和继代培养，获得具有稳定表型的变异株。

三、动物卵低剂量辐射诱变方法

1、诱变材料的选择

用于诱变的动物可以是各种卵生动物，包括一般的鸟类、爬虫类，大部分鱼类和昆虫。如：鸡、鸭、鱼、青蛙、乌龟、蝴蝶、果蝇等。诱变材料为各种动物的卵。

2、低剂量辐射诱变

辐照的剂量与方法与植物低剂量辐射诱变方法相同。

3、变异的选育

具体选育方法与植物低剂量辐射变异的选育方法相同。。

实施例

用低剂量的60Co-γ射线对拟南芥干种子(Greenville生态型和Col-PRL生态型)进行辐照处理，辐照的总剂量为100mGy，辐照处理间断进行，每天辐照剂量为8mGy。分析表明，处理拟南芥在萌发后的较长时期内Hsp90基因的表达发生持续性变化，并且，一些处理群体产生新的表型变异。图1显示的是Greenville生态型拟南芥低剂量辐射诱导突变体。由图1可以看出，星号所标识的拟南芥植株发生了表型变异。图2显示的是Col-PRL生态型拟南芥低剂量辐射诱导突变体。由图2可以看出，框线内的拟南芥植株发生了表型变异。

根据育种目标挑选感兴趣的变异株进行自交留种，或与性状相近的变异株进行杂交留种。在自交和杂交后代中选取目标性状突出的变异株，再进行自交和杂交留种。重复进行3代后即可获得具有稳定性状的突变体。

由此可见，对植物种子进行低剂量电离辐射处理可以作为一种干扰Hsp90功能，诱导变异的有效手段。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。