一种苦苣苔科植物一步成苗组培快繁方法与流程

本发明涉及植物组织培养领域，具体的说是涉及一种苦苣苔科植物一步成苗组培快繁方法。

背景技术：

苦苣苔科(Gesneriaceae)植物多为多年生草本植物，种类繁多，全世界约有140属，2000余种，我国有58属463种。有的种类既耐旱又耐阴、耐湿，有的种类具有很高的药用价值，有的种类株型、叶形、花形变化丰富，花叶兼美，观赏价值高，具有一定的室内观赏盆花开发前景；但目前大多种类尚未进入商品开发阶段，且由于自身的遗传缺陷及野生资源的过度开发，很多具有较高应用价值的苦苣苔科植物已濒临灭菌。

苦苣苔常规繁殖以扦插和种子繁殖为主，因有些苣苔植物自交不孕，结实率低或不结实，故通常以扦插繁殖应用最多，但使用常规繁殖方法无法快速高校地满足科研及大规模生产需要。利用组织培养快速繁殖技术有助于苦苣苔科植物的商品开发和种质资源保存，还有利于苦苣苔科植物的良种选育、人工种子培育、生理代谢研究等工作的进一步开展。

目前，苦苣苔的组织培养技术已有较多报道，但普遍是针对三个阶段，即不定芽的诱导和分化阶段、丛生芽的继代繁殖阶段和生根阶段，设立三种不同培养基进行，操作上不仅繁琐，而且从效果上也较差，主要表现在初代培养不定芽的分化率、继代增殖培养的增殖系数比较低，生根率不高，如专利CN102144556A公开的瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法中，其不定芽分化率仅为31.7％，而繁殖系数仅为4.6/60d，生根率为90.7％；专利CN103141390A公开的红苞半蒴苣苔的繁殖方法，其记载的继代繁殖培养的增殖倍数为3.6倍；CN105325301A公开了一种心叶小花苣苔两步成苗组培快速繁殖的方法，其记载的不定芽分化率最高为86.9％，增殖系数最高为6.1/50d，生根率最高为89.5％/30d。CN104823855A公开的短毛唇柱苣苔组培快繁方法中，增殖系数为15，虽然有所提高，但是仍旧不高。

因此，提供一种一步法组培快繁苦苣苔科植物的方法，可以极大地推动苦苣苔科植物的经济效益。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种苦苣苔科植物一步成苗组培快繁方法，使得所述组培快繁方法仅通过一种培养基即可完成苦苣苔科植物三个阶段的组织培养，同时具备较高的愈伤诱导率、不定芽分化率、丛生芽增殖系数和生根率。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种苦苣苔科植物一步成苗组培快繁方法，包括：

步骤1、取苦苣苔科植物的外植体进行灭菌；

步骤2、将外植体接种到培养基中，先进行暗培养诱导出愈伤组织，而后进行光培养分化出不定芽；

步骤3、将分化出不定芽的芽块转接到新鲜的步骤2所述培养基中进行增殖培养，获得长有丛生芽的有效苗；

步骤4、将有效苗再次转接到新鲜的步骤2所述培养基中进行生根培养，获得完整无菌苗；

其中，步骤2中所述培养基组分包含：

MS盐、white有机物、0.3～0.8mg/L的6-BA、0.15～0.3mg/L的NAA、0.05mg/L的IBA、2.5ml/L的植培灵，25g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0MS盐和white有机物的体积比为3:1。

本发明中所用MS盐和white有机物是培养基中常用的两种组分，其中MS盐表示MS培养基中的大量、微量和铁盐部分，而white有机物表示white培养基中的有机物。

现有苦苣苔植物的组织培养方法一般分为初代诱导分化、丛生芽继代增殖以及生根三个阶段，而每一个阶段都需要特定的培养基来进行培养，进而从愈伤、不定芽、丛生芽到最后的生根，完成无菌苗的快繁。但是三个不同的培养环节给苦苣苔科植物的快繁造成了繁琐复杂的问题，本发明针对这一问题利用组织培养技术和原理，设计一种培养基，同时完成愈伤组织诱导、 分化及丛生芽增殖和生根的过程，即一步法快速获得苦苣苔科植物无菌苗的方法。

作为优选，步骤1为取苦苣苔科植物的外植体用酒精和升汞进行灭菌。

进一步优选地，步骤1为：

取苦苣苔科植株的外植体，用自来水冲洗干净后，移入超净工作台，用75％酒精浸泡30～40s，无菌水清洗2次，然后用加2滴TWeen-20的0.1％HgCl₂溶液处理6～8min，无菌水清洗6～7次；将外植体置于无菌滤纸上吸干水分，待用。

在本发明中，所述苦苣苔科植物优选为报春苦苣苔或小花苦苣苔，其中报春苦苣苔包括钟冠报春苣苔(Primulina swinglei)、博白报春苣苔(Primulina bobaiensis)、钟氏报春苣苔(Primulina zhongiana)；小花苦苣苔包括假密毛小花苣苔(Primulina pseudomollifolia)。而所选用的外植体优选采用苦苣苔科植物的花梗和/或花蕾。

作为优选，所述暗培养在20～25℃下培养，一般时间为2周。所述光培养、增殖培养以及生根培养均优选在20～25℃、光照强度1500～2000lx，光照时间14h/d下培养，三个阶段的培养时间分别为3-4周、2周、2-3周。

本方法以4种苦苣苔植物的花梗和/或花蕾为外植体材料，利用本发明组织培养技术和原理，在一种培养基的前提下完成愈伤组织诱导、分化及丛生芽增殖和生根的过程，其中愈伤组织诱导及分化率高达92％，增殖系数约40～65，生根率95％以上，能够在相对短的时间内获得大量钟冠报春苣苔、博白报春苣苔、钟氏报春苣苔、假密毛小花苣苔无菌苗，达到快速繁育的目的。

由以上技术方案可知，本发明选择特定的一种培养基用于苦苣苔科植物三个阶段的组织培养，通过一步法获得了钟冠报春、博白报春、钟氏报春、假密毛小花苣苔4种苦苣苔科植物无菌苗，建立了简单、高效的组培快繁体系。

附图说明

图1所示为钟冠报春苣苔愈伤组织诱导及分化图；

图2所示为博白报春苣苔愈伤组织形成及分化图；

图3所示为钟氏报春苣苔愈伤组织形成及分化图；

图4所示为假密毛小花苣苔愈伤组织形成及分化图；

图5所示为钟冠报春苣苔丛生芽增殖图；

图6所示为博白报春苣苔丛生芽增殖图；

图7所示为钟氏报春苣苔丛生芽增殖及芽苗生根图；

图8所示为假密毛小花苣苔丛生芽增殖图；

图9所示为钟冠报春苣苔芽苗生根图；

图10所示为博白报春苣苔芽苗生根图；

图11所示为钟氏报春苣苔芽苗生根图；

图12所示为假密毛小花苣苔芽苗生根图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种苦苣苔科植物一步成苗组培快繁方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述组培快繁方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的组培快繁方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种苦苣苔科植物一步成苗组培快繁方法做进一步说明。

实施例1：本发明所述苦苣苔科植物组织培养方法

外植体灭菌：

取钟冠报春、博白报春、钟氏报春、假密毛小花苣苔4种苦苣苔科植物幼嫩花梗和(或)花蕾，用自来水冲洗干净后，移入超净工作台，用75％酒精浸泡30～40s，无菌水冲洗2次，再用0.1％HgCl₂(加2滴TWeen-20)溶液处理6～8min，无菌水清洗6～7次。将花梗和(或)花蕾置于无菌滤纸上吸干水分后，切成0.5～1.0cm长的小段，待用。

愈伤组织诱导及不定芽分化：

将已灭菌并处理好的花梗和(或)花蕾，接种于启动培养基中培养，培养温度25℃，暗培养2周，然后进行光培养(光照强度1500～2000lx，光照 时间14h/d)。所用培养基为：MS盐+white有机物+6-BA 0.3～0.8mg/L+NAA0.15～0.3mg/L+IBA 0.05mg/L+植培灵2.5ml/L，其中培养基的蔗糖含量为25g/L，pH为5.8～6.0。培养3～4周后，获得愈伤组织或分化的芽，诱导分化情况见图1-4。

增殖培养：

将初代培养所得的芽块分割成每块带1～2个芽的小块，转接于新的培养基上生长，所述的培养基仍为MS盐+white有机物+6-BA 0.3～0.8mg/L+NAA0.15～0.3mg/L+IBA 0.05mg/L+植培灵2.5ml/L，在光照1500～2000lx、14h/d，温度25℃的培养条件下培养；生长2周后获得长有丛生芽的有效苗，丛生芽增殖情况见图5-8。

生根培养：

将上述培养所得的无菌健壮有效苗转接到培养基上同时进行增殖和生根培养，所用培养基仍为：MS盐+white有机物+6-BA 0.3～0.8mg/L+NAA0.15～0.3mg/L+IBA 0.05mg/L+植培灵2.5ml/L，培养温度25℃，光照1500～2000lx、14h/d。培养2-3周后，无菌芽苗开始生根，获得完整植株，各报春苣苔生根情况见图9-12。

实施例2：试验统计

试验对象：钟冠报春、博白报春、钟氏报春、假密毛小花苣苔4种苦苣苔科植物；

外植体：花梗和(或)花蕾；

方法：实施例1方法

结果见表1。

表1

由表1可以看出，本发明整个组培快繁工艺仅需要一种培养基，就达到了较高的愈伤诱导率、不定芽分化率、丛生芽增殖系数以及生根率，远比当下需要多种培养基成分的组培方法更有优势。

以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。