麦类作物室内抗小麦矮缩病毒的表型鉴定方法及应用与流程

本发明属于农业生物学
技术领域：
，具体地涉及以较简单的操作鉴定麦类作物室内抗小麦矮缩病毒的表型鉴定技术及应用。
背景技术：
：由小麦矮缩病毒(Wheatdwarfvirus,WDV)引起的小麦矮缩病最早于1961年在前捷克斯洛伐克发现，近年来该病毒的危害逐年加剧。目前已经成为欧洲、非洲和亚洲等大、小麦生产上威胁性很大的病害之一。小麦矮缩病毒是双生病毒科(Geminiviridae)玉米线条病毒属(Mastrevirus)的成员，病毒粒体为孪生颗粒形态。该病毒寄主范围较广，包括小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeumvulgare)，燕麦(Avenasativa)等禾本科作物以及一些杂草，引起植株的严重矮缩、黄化、条斑和分蘖增多等症状。按照寄主范围和基因组序列，目前可划分为3个不同株系，分别为小麦矮缩病毒(Wheatdwarfvirus,WDV)、燕麦矮缩病毒(Oatdwarfvirus,ODV)和大麦矮缩病毒(Barleydwarfvirus,BDV)。小麦矮缩病毒病的传播主要通过介体-条沙叶蝉(PsammotettixstriatusL.)以持久循回方式传播，即条沙叶蝉取食后，病毒随着植物汁液由口针进入到肠道，病毒穿越细胞膜到达血腔后由唾液腺被传出。小麦在拔节之前受到WDV侵染会造成植株严重矮缩，株高通常仅为10-20cm，且植株不再增高，拔节之后，受侵染的小麦分蘖长短不一，根部产生许多的小分蘖，严重时病株在拔节前即死亡，轻病株虽能拔节，但多不抽穗，有的虽抽穗，但籽粒不实。在欧洲，小麦因该病害减产可高达40％-80％。小麦矮缩病毒的发生流行与寄主、病毒、介体等在特定生态环境条件下的相互作用有关。随着全球气候变暖，病毒的传毒介体有了更为广泛的活动领域。随着国际贸易的开放交流，也使得病毒传播到了本来没有的区域。2007年我国首次报道了小麦矮缩病的发生，随后在陕西、甘肃、河北、云南等12个省被发现，在陕西北部麦区已经引起严重的减产，正成为威胁我国西北、华北和西南麦区重要的病毒病。常规治虫防病的措施因一旦看到害虫后介体已完成传毒过程，对小麦矮缩病毒病的防治效果很差，因此培育抗病品种是最为有效的防治策略。由于小麦矮缩病毒由条沙叶蝉专化性传播，病害在田间发生具有偶发性，田间大规模鉴定较为困难，使得抗病性鉴定及其致病性机理等研究工作存在很大的困难，因此需要建立一种简单易行的麦类作物抗矮缩病毒表型鉴定的方法，可利用携带WDV病毒的条沙叶蝉进行室内接种，达到快速有效抗病表型鉴定及繁殖毒源的目的。技术实现要素：针对上述领域中的需求，本发明的目的是提供一种快速有效鉴定麦类作物室内抗小麦矮缩病表型的方法，该方法简单易行，成本低，效率高。同时提供该方法在抗感麦类作物品种资源筛选中的应用。一种麦类作物室内抗小麦矮缩病毒的表型鉴定方法，包括如下步骤：(1)在装满1/4体积的灭菌土的每个种植容器中播种一批待鉴定材料种子；(2)种子种下的第四天后，将介体-条沙叶蝉集中在具有典型症状的小麦矮缩病毒植株上饲喂3天；(3)第七天，将己带毒的条沙叶蝉用吸虫器吸出后放置到种植容器中，容器口用纱网布罩上，放置在光照培养箱内接种3天；(4)第十天将条沙叶蝉吸出，将待鉴定材料剜出，然后分苗移栽种植，最后放置在光照温室或生长箱中生长；(5)种植3-4周后，依据生物学接种鉴定的植株表型来评价麦类作物品种资源的抗性。所述具有典型症状的小麦矮缩病毒植株为小麦(TriticumaestivumL.)品种扬麦12号，经PCR和血清学鉴定为阳性后，条沙叶蝉传毒活体保存在感病品种扬麦12号上。所述条沙叶蝉种群采自陕西韩城，常年在冬小麦幼苗上饲养。所述依据抗性鉴定的植株表型，将病情分级标准定为0,1,2,3,4,5级，其中0级为免疫即无病，1级为高抗，2级为抗病，3级为中感，4级感病，5级为高感。上述步骤(1)、(2)、(3)、(4)的环境条件为温度22℃，且每天16小时光照、8小时黑暗，光照强度为20000Lx。所述种植容器为透明玻璃杯。所述麦类作物为小麦、大麦或燕麦。所述麦类作物为小麦。上述方法在麦类作物品种资源抗性筛选中的应用。本发明的方法，在室内提前三天种植麦类作物，再给介体喂饲病毒3天，此时小麦己发芽，再将己带毒的介体置于种植麦类作物的种植容器中3天，将病毒传给新种植的麦类作物，再将麦类作物分植，长大后进行表型鉴定。本发明方法只需要9－10天的时间完成一次传毒的过程，该方法简单易行，成本低，效率高。鉴定得到的抗性资源可进一步用于品种杂交选育，经田间示范推广可以用于防治小麦矮缩病，小麦感病植株亦可用于致病性以及介体与寄主互作等机制研究。本发明提供的方法是基于传统生物学技术建立的，具体的实施方法是：将介体-条沙叶蝉集中在具有典型症状的小麦矮缩病毒植株上饲喂3天，另一方面工作是提前3天种植待鉴定小麦材料，即在装满1/4体积的灭菌土的每个玻璃杯中播种待鉴定材料种子20粒，条沙叶蝉饲毒第四天即鉴定材料播种生长的第7天，将60-80头带毒条沙叶蝉用吸虫器吸出后放置到玻璃杯子中，瓶口用纱网布罩上，放置在光照培养箱内接种3天，第四天将条沙叶蝉吸出，将玻璃杯子中待鉴定的材料小心用镊子剜出，然后分苗移栽种植，最后放置在光照温室或生长箱中生长，3周后感病对照发病明显，其他待鉴定材料可调查病情。依据抗性鉴定的植株表型，将病情分级标准定为0,1,2,3,4,5级，其中0级为免疫即无病，1级为高抗，2级为抗病，3级为中感，4级感病，5级为高感。本发明提供的小麦抗矮缩病的表型鉴定方法，可按需将WDV病毒分离物通过集中活体饲喂条沙叶蝉使其带毒，然后集中接种到待鉴定的小麦上，最后分苗移栽种植，提供了一种有效简便的寄主抗病性鉴定方法；也为研究WDV病毒致病性或介体条沙叶蝉传播病毒等工作中提供有效的毒源材料；获得的带毒条沙叶蝉可随时支持小麦和大麦等麦类作物品种资源的抗性鉴定，亦可用于在感病品种上大量繁殖WDV，以做提纯病毒，或继而制备抗血清之用。同时0-5级的病情分级标准的制定也为利用抗病资源进行抗病育种等相关工作奠定基础，该项技术可在麦类作物抗病遗传学和抗小麦矮缩病毒转基因的研究工作中作为生物学检测方法应用，为该领域的研究提供可靠的实验技术和方法。总之，该发明的应用将大大加快WDV的基础研究工作。与现有技术相比，本发明具有以下优点：有效克服了室内WDV抗性鉴定的技术瓶颈，将传统的单株单管少量介体接种变成为多株单瓶群体接种，节约了接种所需要的光照培养箱的空间，从而节省了成本；并且首次接种后的介体集中回收后可以多次在毒源上重复饲毒，然后进行下一批次的接种，从而节省了介体饲养的成本，增强了带毒介体使用的有效性，缩短了鉴定周期；另外室内接种没有季节依赖性，能够满足各个季节的需求，可在可控温温室条件下周年随时操作，拓宽了品种抗性鉴定时间，增加了工作效率；简化了国外专家沿用的0-9级的分级标准，依据植株表型重新划分了0-5级的WDV病情分级，3级以下为抗病，3级以上(含3级)为感病，规范了国内小麦矮缩病毒抗性评价标准。附图说明图1.条沙叶蝉在活体毒源植株叶片上取食；图2.条沙叶蝉从毒源植株转移至待鉴定的小麦幼苗上取食；图3.条沙叶蝉带毒率的PCR检测电泳图；其中：M代表DL1000DNAMarker,从上到下依次为1000bp,700bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp；1～11泳道依次为叶蝉的1-11号样品，12泳道为空白对照，13泳道为阳性样品对照。图4.具有典型症状的小麦矮缩病毒发病株；图5.接种小麦植株的PCR检测的电泳图；其中：M代表DL1000DNAMarker,从上到下依次为1000bp,700bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp；1～10泳道依次为接种植株的1-10号样品，第11泳道为阳性样品对照，第12泳道为空白对照。图6.小麦矮缩病毒室内抗性鉴定分级标准；从左到右A-F植株分别对应0,1,2,3,4,5级表型。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。需特别指出的是，尽管本发明是针对寄主小麦抗小麦矮缩病的鉴定技术，但应用本发明对任何引起小麦矮缩病的相近株系如大麦矮缩病毒、燕麦矮缩病毒的鉴定方法以及寄主大麦、燕麦、黑麦等以外的麦类种质资源及近缘种质均也包括在本发明所要求的权利范围之内。实施例1.毒源与介体的准备所述的小麦矮缩病毒(WDV)毒源是小麦矮缩病毒陕西韩城分离物，挑选症状明显的植株经PCR和血清学鉴定为阳性后，活体保存在寄主小麦上。传毒介体-条沙叶蝉[Psammotettixstriatus(Linnaeus)]采自陕西韩城，经脱毒纯化后在健康小麦上常年扣罩饲养繁殖。所述的介体饲养和作为饲料及传毒寄主的小麦品种扬麦12号均饲养在22℃光照培养箱内，16h光照、8h黑暗，光照强度为20000Lx。实施例2.介体的饲毒与接种用吸虫器吸取60-80头条沙叶蝉，放置在小麦矮缩病毒毒源植株上扣罩饲喂3天(图1)，另一方面工作是提前3天种植待鉴定小麦材料，即在装满1/4体积的灭菌土的每个玻璃杯中播种待鉴定材料的种子25粒，鉴定材料播种生长的第7天即介体饲毒第四天，将所有经饲毒的条沙叶蝉用吸虫器吸出后放置到有待鉴定品种幼苗的玻璃杯子中，瓶口立即用纱网布罩上、皮筋勒紧(图2)。然后放置在光照培养箱内接种3天，第四天将条沙叶蝉全部吸出，将玻璃杯子中待鉴定的材料小心用镊子剜出，然后分苗移栽种植至10cm口径的小花盆中，最后放置在22℃控温控光温室或生长箱中生长，实验以感病品种扬麦12号作为对照。接种3周后感病对照发病明显，其他待鉴定材料可调查病情。实施例3.条沙叶蝉经饲毒后PCR检测群体带毒率将饲毒过的条沙叶蝉用吸虫器取出，单头提取叶蝉的总DNA。采用Promega公司的WizardGenomicDNA提取试剂盒，提取方法参考说明书略作改动。提取好的DNA样品于-20℃保存备用。PCR扩增引物为CP/F:5‘-ATGGTGACCAACAAGGACTCC-3’；CP/R:5‘-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以总体系50μL为例，PCR扩增体系如下：rTaq0.25μL；10×PCRBuffer5μL；dNTPMixture(各2.5mmol/L)4μL；上游引物和下游引物(10μmol/L)各2μL；DNA(10ng/μL)2μL，ddH2O34.75μL。PCR扩增程序：94℃3min；(94℃45sec，退火温度50sec，72℃30sec)×30个循环；72℃5min。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明：在检测的30头叶蝉中有23头扩增出阳性条带(部分电泳图片见图3)，带毒率为76.6％。检测结果表明此批条沙叶蝉经取食活体毒源后带毒虫高达四分之三以上。实施例4.抗病鉴定的生物学表型统计接种待鉴定小麦材料3周后，观察发现部分小麦出现明显的小麦矮缩病毒症状，典型症状表现为：叶片僵直，叶尖发黄、并逐步向下蔓延，部分植株表现明显矮化，部分植株提早出现分蘖(见图4)。生物学表型统计结果如下表：品种名接种总株数病株数发病率(％)扬麦12号(感病对照)4848100.00科农1995050100.00蚂蚱麦4848100.00晋麦90484593.75襄农20364900.00冀曲麦12号5000.00实施例5.PCR检测生物学典型病株将实施例4得到的每个待测品种各取10株生物学表型为感病的植株取0.2g新鲜叶片采用传统的buffer“S”法提取小麦总DNA，溶于100μLddH2O中，-20℃冰箱暂时保存备用。采用PCR检测方法验证生物学结果，引物及扩增条件见实施例4，电泳结果显示所获得的10株植株中均为阳性，阳性率为100％(部分电泳结果见图5)，结果显示生物学表型为感病的植株经PCR检测全部为阳性，表明生物学接种成功。实施例6.小麦矮缩病毒室内抗性鉴定分级标准为了进一步研究品种的致病性及抗性差异，因此很有必要划分品种对WDV的抗性级别，采用目测法将室内抗性鉴定的植株划分为对应6个表型，分别是0,1,2,3,4,5级(如图6)。抗性分级具体如下：鉴定得到的抗性资源可进一步用于品种杂交选育，经田间示范推广可以用于防治小麦矮缩病，感病植株亦可用于致病性以及介体与寄主互作等机制研究。当前第1页1 2 3