一种宫颈细胞保存液的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种细胞保存液，尤其涉及一种宫颈细胞保存液。
背景技术：
：现有的HPV(人乳头瘤病毒)分型检测中，样本处理是一个关键环节，直接决定最终结果的准确性。目前的宫颈细胞保存液为生理盐水，该细胞保存液的样本处理存在如下所述的干扰因素：1、血样标本，进行HPV检测的样本中约有三分之一的样本为血性，红细胞在提取DNA的过程中破裂后的主要成分为血红蛋白等，血红蛋白无法彻底去除，直接影响后续的PCR(聚合酶链式反应)过程，对此过程产生抑制作用，造成结果假阴性。2、粘液样本，进行HPV检测的样本中约有一半的样本含有粘液。粘液的存在影响样本的吸取过程，造成吸样不足，造成假阴性。为此，现有的宫颈细胞保存液需要先进行洗脱处理后才能进行HPV检测，使得处理过程变得繁琐，一旦跳过洗脱处理，容易产生误判从而对患者健康产生不利影响。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有技术的PBS缓冲液细胞保存液需要先进行洗脱处理后才能进行HPV检测的不足，提供一种宫颈细胞保存液。为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：一种宫颈细胞保存液，其特征在于：包括PBS缓冲液、十二烷基三甲基氯化铵和蛋白酶K，所述十二烷基三甲基氯化铵先混入PBS缓冲液中形成初次保存液，所述十二烷基三甲基氯化铵在初次保存液中的质量百分比浓度为5-15％；所述蛋白酶K后混入所述初次保存液形成成品保存液，所述蛋白酶K与所述初次保存液的质量体积比浓度为4-6mg/ml。所述PBS缓冲液为含0.05％吐温-20的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(简称PBS-T).采用上述宫颈细胞保存液具有如下优点：1、本发明的宫颈细胞保存液中的十二烷基三甲基组分可以破坏红细胞起到溶血作用,蛋白酶K可以有效分解粘液,PBS缓冲剂可以起到保存宫颈细胞的作用。2、本发明的宫颈细胞保存液无需进行洗脱处理就可以直接进行检测，并且检测精度与现有宫颈细胞保存液洗脱后的检测精度相当，简化了操作步骤，提高了HPV病毒的检测效率。3、本发明的宫颈细胞保存液原料便宜易得,易于制备。附图说明图1为HPV.16+PCR扩增标准曲线，横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数。图2为分别使用厂家细胞保存液及本发明细胞保存液对HPV16+进行保存提取扩增得到的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数。图3为分别使用厂家细胞保存液及本发明细胞保存液对HPV18+进行保存提取扩增得到的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数。图4为分别使用厂家细胞保存液及本发明细胞保存液对HPV31+进行保存提取扩增得到的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数。图5为分别使用厂家细胞保存液及本发明细胞保存液对HPV58+进行保存提取扩增得到的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数。图6为分别使用厂家细胞保存液及本发明细胞保存液对HPVCP8304进行保存提取扩增得到的扩增曲线，横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数。图7显示了通过导流杂交法验证型别鉴定试验来验证本发明所起到的作用。具体实施方式实验例1实验了宫颈细胞保存液中十二烷基三甲基氯化铵的质量分数对红细胞破碎效果和对HPV检测结果的影响：实验过程如下：由十二烷基三甲基氯化铵混入PBS缓冲液中形成初次保存液；PBS缓冲液为含0.05％吐温-20的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。将含有不同质量百分比的十二烷基三甲基氯化铵的初次保存液分别置于不同反应容器中且清晰标记，从同一宫颈细胞样本中分别取样放入各自的反应容器中，在相同条件下反应后记录反应结果如下表；表1：反应结果如表1所示：当十二烷基三甲基氯化铵在初次保存液中的质量百分比为5％时溶血效果较好，并且对HPV的检测结果无抑制现象，当十二烷基三甲基氯化铵在初次保存液中的质量百分比为10％、15％时可以做到完全溶血并且对HPV的检测结果无抑制现象，当十二烷基三甲基氯化铵在初次保存液中的质量百分比为20％、25％时可以做到完全溶血，但对HPV的检测结果有部分抑制现象，当保存液中不含十二烷基三甲基时，完全没有溶血并且对HPV的检测结果完全抑制，综上，优选的十二烷基三甲基氯化铵的质量百分比为5％-15％，最优选的十二烷基三甲基氯化铵的质量百分比为10％。实验例2实验了相同体积的含有质量百分比为10％十二烷基三甲基氯化铵的初次保存液中，分别加入不同质量的蛋白酶K，形成不同质量体积比浓度的成品保存液对对粘液的处理效果和对HPV检测结果的影响。实验过程如下：在相同体积的含有质量百分比为10％十二烷基三甲基氯化铵的初次保存液中，分别加入不同质量的蛋白酶K，形成蛋白酶K与初次保存液的质量体积比浓度不同的多个成品保存液，置于不同反应容器中标记清晰，从同一样本中分别取样放入各自的反应容器中，在相同条件下进行反应后，记录反应结果如表2；表2：蛋白酶K的质量体积比浓度处理粘液的效果对HPV结果的影响(质控IC点)1mg/mL不完全部分抑制2mg/mL不完全部分抑制3mg/mL完全部分抑制4mg/mL完全无抑制现象5mg/mL完全无抑制现象6mg/mL完全无抑制现象7mg/mL完全部分抑制8mg/mL完全部分抑制9mg/mL完全部分抑制反应结果如表2所示：当蛋白酶K与初次保存液的质量体积比浓度分别为4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml时，可以完全处理粘液并对HPV的检测结果无抑制现象；当蛋白酶K与初次保存液的质量体积比浓度分别为3mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml时可以完全处理粘液并对HPV的检测结果有部分抑制现象；当蛋白酶K与初次保存液的质量体积比浓度分别为1mg/ml、2mg/ml时，处理粘液并不完全并且对HPV的检测结果有部分抑制；综上所述，优选的蛋白酶K与初次保存液的质量体积比浓度为4-6mg/ml，最优选的蛋白酶K与初次保存液的质量体积浓度比为5mg/ml。实验例4实验了本发明的宫颈细胞保存液(十二烷基三甲基氯化铵在初次保存液中的质量百分比为10％，蛋白酶K与初次保存液的质量体积比浓度为5mg/ml)在不洗脱的情况下对比现有技术的厂家宫颈细胞保存液(潮州凯普生物化学有限公司生产的细胞保存液，主要成分：PBS)在洗脱的情况下荧光定量PCR技术验证实验中所产生的曲线及CT值是否有差别；实验之前，需进行HPV.16+PCR扩增，得到标准曲线，如图1所示。实验时，用5例宫颈细胞血性样本，分别采用本发明不洗脱、厂家细胞保存液洗脱操作，通过荧光定量PCR技术验证使用本发明不洗脱与厂家细胞保存液洗脱两种操作所产生的曲线及CT值有无差别，实验结果如图2-6所示，其中：横坐标为循环数，纵坐标为拷贝数；实验结果表明，所示五例实验中所产生的曲线与现有技术的基本重叠，说明本发明有效且不会抑制PCR过程。实验例5实验了本发明(十二烷基三甲基氯化铵在初次保存液中的质量百分比为10％，蛋白酶K与初次保存液的质量体积比浓度为5mg/ml)在不洗脱的情况下对比现有技术的厂家宫颈细胞保存液(潮州凯普生物化学有限公司生产的细胞保存液，主要成分：PBS)在洗脱和不洗脱的情况下进行导流杂交法验证型别鉴定试验来验证本发明所起到的作用，如图7所示，该实验结果由HPV探针薄膜分型示意图表示，分型示意图由四排六列的表格组成，表格的左上角为用于检测膜条是否有效的Biotin点，Biotin点正下方的一个格子为检测PCR过程中是否存在抑制物，扩增效率及DNA浓度的质控IC点，其余每个格子各代表一种HPV病毒亚型。实验结果将记载于探针膜条上，探针膜条上设有与分型示意图相对应的表格，Biotin点1与IC点2分别与HPV薄膜分型示意图的表格位置相对应，检验到的HPV病毒亚型所处的格子也与HPV探针薄膜分型示意图相对应。实验后的探针膜条如图7所示，一排共有五组实验样本1001-1005，其从左到右，第一至第四为样本1001-1004，是含血样本，第五为样本1005，是不含血样本，图7中的三排分型示意图分别对应三种实验情况，第一排为本发明的细胞保存液组不洗脱的实验情况，第二排为现有技术的细胞保存液组洗脱后的实验情况，第三排现有技术的细胞保存液组不洗脱的实验情况，实验结果的具体说明如下表3所示：实验结果表明：本发明的细胞保存液的实验情况和现有技术的细胞保存液洗脱后的实验情况一致，而现有技术的细胞保存液组在不洗脱的情况下HPV检测结果会被抑制。实验结果表明了本发明的细胞保存液在免去洗脱步骤的条件下也能够拥有和现有技术中的细胞保存液经过洗脱处理后的HPV检测精度。总结上述实验例，本宫颈细胞保存液具有操作简便，制备容易，对血性样本和粘液样本的处理效果较好且不会发生抑制现象的优点。当前第1页1 2 3