一种以下胚轴为外植体的红椿再生方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以下胚轴为外植体的红椿再生方法。

背景技术：

红椿(Toona ciliata Roem.)，隶属楝科(Meliaceae)香椿属(Toona)。该树种材质优良，纹理优美，由于其木材呈现红色，坚韧耐腐，常作为高档家具用材出口国际，开发潜力巨大，被誉为“中国桃花心木”。由于环境的变化、天然更新能力较差、过度的人为破坏及需求量的不断增加，红椿数量在持续减少，已成为珍贵的濒危树种，被列为国家Ⅱ级重点保护野生植物。红椿在印度、老挝、缅甸、泰国、巴基斯坦、澳大利亚东海岸具有天然分布，并在世界多地进行引种。在我国集中分布在华南、华中、华东及西南地区，呈零星或散点分布。红椿用途广泛，不仅作为珍贵木材享誉国内外，还由于其挺拔的树姿被用于行道树，同时，红椿的药用价值在国内外不断地进行开发和利用，可谓经济利用价值极高。

红椿天然更新能力较差，在分布区内多以古树形式存在，其繁殖方式主要为种子繁殖，但由于红椿成年大树较为通直高大，人工采种较为困难，且种子的有效保存时间较短，从而制约了红椿的推广和发展。为了满足种苗市场需求，红椿的扦插育苗、嫁接及组织培养技术得到很多的关注。相较于扦插和嫁接，组织培养技术可以有效地解决生根问题，并提高繁殖系数，实现良种规模化生产，快速获得优质种苗。

由于无法彻底有效地解决红椿内生菌问题，目前所报道的红椿组织培养研究普遍会产生增殖效果不佳、诱导率较低且生根困难等问题。国外相关研究主要集中是采集成年大树及2年生幼苗外植体进行离体培养；国内则建立了以种子及成年大树带芽茎段作为外植体的组培体系，但增殖情况并不理想。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种以红椿下胚轴为外植体的操作更简便、取材更广泛的高效的红椿再生方法，利用该方法能够在短期内快速获得大量优质的红椿种苗。

本发明的以下胚轴为外植体的红椿再生方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、外植体的获得：将红椿种子去掉双侧翅，在水中浸泡3～5h，经消毒后将种子播种于固体MS培养基上培养得到无菌苗，切取无菌苗的下胚轴作为外植体；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d；

B、芽的诱导及伸长：将下胚轴接种到芽诱导培养基上培养诱导愈伤组织，接种时下胚轴平铺于培养基；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d；培养至外植体上分化出芽点时，将长芽的外植体转移到芽伸长培养基上在相同培养条件下培养诱导不定芽伸长；

所述的芽诱导培养基：每升含有6-BA 0.3～0.8mg、KT 0.5～1.5mg、IBA0.05～0.15mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8～6.0；

所述的芽伸长培养基：每升含有6-BA0.05～0.2mg、NAA 0.1～0.3mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8～6.0；

C、生根培养：待不定芽伸长到3～5cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导生根，得到生根苗；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d；

所述的生根培养基：每升含有NAA0.1～0.3mg、蔗糖15g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8～6.0；

D、炼苗及移栽：将生根苗炼苗后从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将生根苗在自来水中浸泡1h，移栽到泥炭土上，进行栽培管理，得到红椿植株。

优选，所述的步骤A的消毒是将红椿种子用体积分数75％乙醇水溶液灭菌1min，无菌水冲洗1次，质量分数10％次氯酸钠水溶液灭菌15～20min，无菌水冲洗3～5次。

优选，所述的步骤D的炼苗是打开培养瓶盖让生根苗适应1d。

优选，所述的步骤D的泥炭土是高温灭菌过的泥炭土。

所述的步骤A的固体MS培养基每升含有蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8～6.0。

所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见Murashige T,Skoog F(1962)A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures.Physiol Plant 15:473–497。

本发明的以下胚轴为外植体的红椿高效组织培养和植株再生方法，可摆脱外界条件的影响，规模化和工厂化生产出健壮、整齐一致的红椿组培幼苗；与已经报道的以红椿大树茎段作为外植体构建再生体系相比，具有操作方便、取材广泛、可重复性强及效率高等优势。该方法可能满足市场对种苗的需求，为红椿种质资源可持续利用奠定基础。

附图说明

图1为种子培养15d后得到的无菌苗，用于切取下胚轴。

图2为在芽诱导培养基上培养30d的下胚轴外植体上的芽点。

图3为在芽伸长培养基上培养25d伸长的不定芽。

图4为不定芽在生根培养基上培养30d后诱导出的根。

图5为移栽成活的红椿植株。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

A、外植体的获得：将红椿种子去掉双侧翅，在水中浸泡4h；在无菌超净台上，用体积分数75％乙醇水溶液灭菌1min，无菌水冲洗1次，质量分数10％次氯酸钠水溶液灭菌15min，无菌水彻底冲洗3次，然后将种子播种于固体MS培养基中培养，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。种子培养3d左右开始萌芽，培养15d后得到无菌苗(如图1所示)，切取下胚轴作为外植体。所述固体MS培养基每升含有蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。

B、芽的诱导及伸长：将下胚轴接种到芽诱导培养基上培养诱导愈伤组织，接种时下胚轴平铺于培养基；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。下胚轴切口处开始有愈伤出现，在培养30d后，逐渐分化出芽点(如图2所示)，将长芽的外植体转移到芽伸长培养基上在相同培养条件下培养诱导不定芽伸长。培养25d后伸长的不定芽如图3所示。所述的芽诱导培养基：每升含有6-BA 0.5mg、KT 1.0mg、IBA0.05mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。所述的芽伸长培养基：每升含有6-BA0.1mg、NAA 0.2mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。

C、生根培养：待不定芽伸长到4cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导生根，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。生根培养30d后，不定芽长出多条根得到生根苗，生根情况如图4所示。所述的生根培养基：每升含有NAA0.15mg、蔗糖15g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。

D、炼苗及移栽：打开培养瓶盖让生根苗适应1d，然后小心将生根苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将生根苗在自来水中浸泡1h，移栽到装在营养杯中的高温灭菌过的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。移栽成活的红椿植株如图5所示。

实施例2

A、外植体的获得：将红椿种子去掉双侧翅，在水中浸泡3h；在无菌超净台上，用体积分数75％乙醇水溶液灭菌1min，无菌水冲洗1次，质量分数10％次氯酸钠水溶液灭菌15min，无菌水彻底冲洗3次，然后将种子播种于固体MS培养基中培养，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。种子培养3d左右开始萌芽，培养10d后得到无菌苗，切取下胚轴作为外植体。所述固体MS培养基每升含有蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。

B、芽的诱导及伸长：将下胚轴接种到芽诱导培养基上培养诱导愈伤组织，接种时下胚轴平铺于培养基；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。下胚轴切口处开始有愈伤出现，在培养25d后，逐渐分化出芽点，将长芽的外植体转移到芽伸长培养基上在相同培养条件下培养诱导不定芽伸长。所述的芽诱导培养基：每升含有6-BA 0.3mg、KT 0.5mg、IBA0.1mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基；配制方法是将上述成份混合均匀，然后灭菌备用。所述的芽伸长培养基：每升含有6-BA0.05mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。

C、生根培养：待不定芽伸长到3cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导生根，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。生根培养30d后，不定芽长出多条根得到生根苗。所述的生根培养基：每升含有NAA0.1mg、蔗糖15g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 5.8；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。

D、炼苗及移栽：打开培养瓶盖让生根苗适应1d，然后小心将生根苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将生根苗在自来水中浸泡1h，移栽到装在营养杯中的高温灭菌过的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。由此得到移栽成活的红椿植株。

实施例3

A、外植体的获得：将红椿种子去掉双侧翅，在水中浸泡5h；在无菌超净台上，用体积分数75％乙醇水溶液灭菌1min，无菌水冲洗1次，质量分数10％次氯酸钠水溶液灭菌20min，无菌水彻底冲洗5次，然后将种子播种于固体MS培养基中培养，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。种子培养3d左右开始萌芽，培养20d后得到无菌苗，切取下胚轴作为外植体。所述固体MS培养基每升含有蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 6.0；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。

B、芽的诱导及伸长：将下胚轴接种到芽诱导培养基上培养诱导愈伤组织，接种时下胚轴平铺于培养基；培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。下胚轴切口处开始有愈伤出现，在培养35d后，逐渐分化出芽点，将长芽的外植体转移到芽伸长培养基上在相同培养条件下培养诱导不定芽伸长。所述的芽诱导培养基：每升含有6-BA 0.8mg、KT 1.5mg、IBA0.15mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 6.0；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。所述的芽伸长培养基：每升含有6-BA0.2mg、NAA 0.3mg、蔗糖30g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 6.0；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。

C、生根培养：待不定芽伸长到5cm时，切取不定芽，接种于生根培养基上培养诱导生根，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h/d。生根培养30d后，不定芽长出多条根得到生根苗。所述的生根培养基：每升含有NAA0.3mg、蔗糖15g和琼脂5g，余量为MS培养基，pH 6.0；配制方法是将上述成份混合均匀，调pH，然后灭菌备用。

D、炼苗及移栽：打开培养瓶盖让生根苗适应1d，然后小心将生根苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将生根苗在自来水中浸泡1h，移栽到装在营养杯中的高温灭菌过的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。由此得到移栽成活的红椿植株。