本发明属于植物生物技术领域，涉及一种通过组织培养技术促进植物再生的方法，具体黄花矶松的组织培养方法。
背景技术：
黄花矶松(Limoniumau-reum)又称金色补血草、黄花补血草，是多年生草本。黄花矶松属于兰雪科补血草属植物，它是干旱荒漠地区为数不多的野生花卉之一，花色艳丽，开花延续时期较长。根为直根系，粗大，全株平滑，株高20～50cm，粗放管理、极耐干旱、花期长，是丰富北方城市绿化建设中地被植物品种的重要种质资源，而且又是防风固沙的优良植物。黄花矶松极具抗干旱高温、耐盐碱和耐贫瘠的特点，在敦煌的沙质戈壁滩能忍受降水量50mm，地表温度55℃的干旱高温环境；在北方干旱地区不需浇水，在气温-36℃以内可安全越冬；土壤pH9以下、含盐量4‰以内可正常生长开花。其药用价值具有止痛、消炎、补血之功效，在国内已开展相关研究。该物种不仅有良好的经济效益，而且在保护生态环境方面也具有很好的生态效益，其开发利用前景广泛。
黄花矶松目前的繁殖方法主要是种子繁殖，但其一采集种子困难，成熟期不整齐，不稳定，品质易退化，其二如果依靠人工育苗，但其易受季节和周期的限制，繁殖缓慢。因此，通过组织培养的方法可作为研究黄花矶松育苗的方向之一。
近年来，关于黄花矶松的的组织培养已有文献进行了报道，但文献报道的黄花矶松组织培养的外植体多选择种子，子叶或者茎段，培养基主要采用MS培养基，但这样极易引起褐化现象，并且不易生根。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种黄花矶松的组织培养方法，该方法包括如下步骤：
(1)外植体的选择与灭菌：取黄花矶松花序消毒灭菌，用自来水冲洗30-40min，吸水纸吸去水分后在70-75％的酒精中冲洗1-2min，再用0.1％的升汞溶液处理8-10min，无菌水淋洗6-7次，用已灭菌的滤纸吸干，黄花矶松的花序为2-3天后将要开放的花蕾；
(2)外植体诱导：将灭菌处理好的花序接入改良的B5培养基上，在B5培养基基础上添加植物激素，其浓度分别为：2，4-D 0.02-0.08mg/L、KT 0.2-0.8mg/L、NAA 0.05-0.1mg/L，加入食用白砂糖20-40g/L、卡拉胶3-5g/L，在诱导条件为，温度25±2℃，光照强度1500-2000lx，光照时间12-16h/d的诱导条件下诱导15-20天诱导出愈伤；
(3)继代增殖培养：将步骤(2)诱导出的黄花矶松愈伤取出，接种于配方为改良B5的继代增殖培养基上，在B5基础培养基上添加植物激素的浓度为：KT0.5-0.8mg/L、NAA 0.05-0.1mg/L、加入食用白砂糖20-40g/L、卡拉胶3-5g/L，在温度为25±2℃，光照强度1500-2000lx，光照时间12-16h/d的条件下增殖培养30-40天，增殖出黄花矶松不定芽；
(4)生根培养：将步骤(3)增殖培养出的黄花矶松不定芽转入配方为B5+IBA0.1mg/L生根培养基中，加入食用白砂糖20-40g/L，卡拉胶3-5g/L，在温度为25±2℃，光照强度1500-2000lx，光照时间12-16h/d的条件下生根培养5-7天获得无菌苗。
在本发明中，在本领域技术人员公知范围内，KT、NAA、IBA、2，4-D分别是6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸、2，4-二氯苯氧乙酸的简称。
本发明的技术方案中
1)初代诱导培养基：B5+KT 0.2-0.8mg/L+NAA 0.05-0.1mg/L+2，4-D0.02-0.08mg/L，2，4-D优选0.05mg/L、KT浓度优选0.5mg/L、NAA优选0.1mg/L。2，4-D可诱导愈伤的分化，侧芽的萌发与生长，该诱导培养基不仅诱导率高，而且每个外植体新增芽数多，其诱导率可达84.8％。
2)增殖培养基：B5+KT 0.2-0.8mg/L+NAA 0.05-0.1mg/L，植物激素浓度范围为KT优选0.5mg/L；NAA优选0.1mg/L，适当浓度的NAA对黄花肌松不定芽的形成有促进作用。
3)生根培养基：改良B5+IBA 0.1mg/L，该生根培养基生根效果较好，生根率达92.1％。生根基部可新增带根的丛生芽，平均可达3-4个。在培养基中加入恰当浓度的IBA可提高和改善生根时间、根的长度和生根率。
本发明筛选出用于黄花矶松组织培养的适宜外植体以及在不同时期的最佳培养基，确定了培养基中各激素的配比，按照本发明的配方配制的培养基可满足了黄花矶松各个时期的营养需要和生长发育。提高了组织培养过程中的诱导率和生根率，
本发明的组织培养法繁殖不受自然条件限制，且诱导率和生根率高，可以不断进行大量繁殖，在短期内可获得大量的小苗，解决了栽培中种源较少的问题，同时可以有效降低品种的退化率，为今后的研究以及规模化，产业化生产提供保障，为该物种在园林建设中的大量推广普及提供技术支撑；同时，也为西北地区物种保护和资源快速更新提供科学依据。
具体实施方式
实施例中统计计算公式
成活率＝(有生活力的外植体数/接种的外植体总数)×100％
初代芽诱导率＝(出芽的外植体数/接种的外植体总数)×100％
继代增殖倍数＝(诱导出的丛生芽数/接入单株芽的总数)×100％
生根率＝(分化根的外植体数/接种的外植体总数)×100％
(1)外植体的选择与灭菌，取开花前2-3天将要开放的花蕾，用自来水冲洗30-40min，吸水纸吸去水分后在70-75％的酒精中冲洗1-2min，再用0.1％的升汞溶液处理8-10min，无菌水淋洗6-7次，用已灭菌的滤纸吸干，接种在改良的B5培养基中。
外植体对黄花肌松成活率及不定芽诱导的影响
分别选取黄花肌松的花序、子叶、茎段接种于B5+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+2，4-D 0.05mg/L诱导培养基上，附加食用白砂糖30g/L，卡拉胶3.5g/L，培养条件为：培养温度，25±2℃；光照强度为1500-2000lx；光照时间为每天12-16小时。第30天分别统计诱导率。结果如表1所示，同样的培养条件下，外植体为花序时，黄花矶松的诱导率为84.8％。
表1部位对黄花肌松愈伤诱导的影响
(2)外植体诱导
将黄花矶松的花序接入诱导培养基后，培养条件为：培养温度，25±2℃；光照强度为1500-2000lx；光照时间为12-16h/d。培养15-20天，开始产生愈伤组织，在含有2，4-D的培养基中20天左右产生结构紧密，淡绿色的不定芽，逐渐增加2，4-D的浓度，不定芽诱导率随着2，4-D浓度的增加而增加，但继续增大2，4-D浓度，不定芽诱导率呈下降趋势，说明过量的2，4-D有抑制芽形成的副作用。
从表2可见，7种激素组合均可诱导黄花矶松花序诱导出愈伤，但各个组合的分化率不同，3号B5+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+2，4-D 0.05mg/L是黄花矶松花序的最佳诱导培养基，不但诱导率高，而且每个外植体新增芽数多，分化率最高，其分化率可达80.9％。结果如表2所示。
表2激素浓度及其组合对黄花矶松花序愈伤诱导的影响
(3)继代增殖培养
将以上诱导出的黄花矶松愈伤取出，接种于附加不同浓度KT和NAA的B5培养基上，附加食用白砂糖30g/L，卡拉胶3.5g/L，培养条件为：培养温度，25±2℃；光照强度为1500-2000lx；光照时间为每天12-16小时。30后天观察不同激素组合条件下的增殖率及分化情况。从表3可见，9种激素组合均可诱导黄花矶松产生增值体系，但各个组合的不定芽生长状况不同，当激素配比为5号时，其增殖倍数和不定芽生长情况都较优，所以B5+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L是黄花矶松不定芽增殖生长状况最佳培养基。
表3激素浓度及其组合对黄花矶松不定芽增殖的影响
(4)生根培养
将继代培养基中长势较好的苗，分成单株转入生根培养基中，每瓶接入4株，培养条件为：培养温度，25±2℃；光照强度为1500-2000lx；光照时间为每天12-16小时，观察记录不同培养基上苗的生根情况，7天后统计生根率。
从生根培养7天的试验结果来看，两个培养基对根的形成均有诱导作用，其中2号生根培养基生根效果较好，生根率达88.7％。不加任何激素的B5培养基也可诱导黄花矶松幼苗生根，但是生根数量较少，且根比较细长，当培养基中加入激素生IBA，根的数量，生根率均有所提高，所以，适宜生根的培养基优选B5+IBA 0.1mg/L(见表4)。
表4无机盐对幼苗生根的影响
从附表中可以看出，本方法诱导率和生根率高，黄花矶松可以不断进行大量繁殖。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。