本发明涉及一种白僵蚕的人工制备方法。
背景技术：
白僵蚕为蚕蛾科动物家蚕蛾的幼虫感染白僵菌而僵死的全虫。白僵蚕是一味药用价值较高的中药，其味咸、辛，性平，可治面上黑及碍容性疾病，白僵蚕含有氨基酸和活性丝光素，有营养皮肤和美容作用；含蛋白质有刺激上皮脂腺，调节性激素分泌的作用；含维生素E，能清除自由基，抗脂质氧化形成的老年斑；含活性丝光素能促使皮肤细胞新生，调节皮脂，改善皮肤微循环，可增白防晒。
过去白僵蚕均为自然死亡，后来进行人工接种培养，在蚕4次蜕皮，接种后，蚕陆续发病死亡，及时拣出，另行摊放，保持同样温度，待其充分发僵变白后，置于通风处，风干或弱光下晒干。然而现有的人工生产的白僵蚕，仍然存在一些问题，如感染后的蚕体从死亡到僵化时间较长，白僵蚕的僵化率较低，僵化时间不整齐，质量不稳定，产量较低，成本也较高，不能达到产业化生产。
技术实现要素：
有鉴于此，本申请提供一种白僵蚕的人工制备方法，其采用的球孢白僵菌孢子液经过复壮，提高了攻毒活性，僵化率高，通过攻毒、蚕体培养、白僵蚕培养过程中温度、湿度等条件的改进，缩短了白僵蚕成品的制备周期，提高了白僵蚕的产量和质量。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种白僵蚕的人工制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)球孢白僵菌孢子液的制备：用无菌水浸泡、清洗白僵蚕蚕体，过滤后取滤液，经过一级斜面培养、二级种子培养、三级扩大培养后得球孢白僵菌孢子液；
(2)病原攻毒：步骤(1)所述球孢白僵菌孢子液在制成后的45min内，迅速喷施于5龄起蚕的蚕体，喷施完成后密闭蚕房1-1.5h；
(3)蚕体培养：打开步骤(2)所述蚕房，对蚕体喂食，每隔3-4h喂食一次，直至蚕体死亡；
(4)白僵蚕培养：将步骤(3)死亡后的蚕体转移至蚕座上，在温度为25-28℃，湿度为95-98％的条件下继续培养至蚕体僵化，并长出白色菌丝分生孢子；
(5)白僵蚕成品制备：将步骤(4)长出白色菌丝分生孢子的白僵蚕收集后干燥至水分小于10％，即得白僵蚕成品。
优选的，步骤(1)所述一级斜面培养的温度为25-28℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的温度为5-10℃。
优选的，步骤(1)所述二级种子培养和三级扩大培养的培养基，其组分按重量百分比计包括：PDA培养基，补充10-20％马铃薯淀粉、5-20％蔗糖、10-15％蛋白胨、0.1-0.5％磷酸二氢钾、0.01-0.05％硫酸镁、5-15％蚕蛹粉、0.01-0.05％维生素B、0.01-0.05％维生素C、0.05-0.1％氯化铁、0.05-0.1％氯化钙。
更为优选的，步骤(1)所述二级种子培养和三级扩大培养的培养基，其组分按重量百分比计包括：补充18％马铃薯淀粉、15％蔗糖、12％蛋白胨、0.3％磷酸二氢钾、0.02％硫酸镁、12％蚕蛹粉、0.03％维生素B、0.02％维生素C、0.08％氯化铁、0.06％氯化钙。
优选的，步骤(2)所述病原攻毒的温度为22-24℃，湿度为98％以上。
优选的，所述步骤(2)喷施球孢白僵菌孢子液时，喷施的次数为3-4次，每次喷施的间隔时间为10-20min。
优选的，步骤(2)所述的球孢白僵菌孢子液的浓度为4.8-5.8万个/cm3。
优选的，步骤(3)所述蚕体培养中，保持温度在24-25℃，湿度为94-95％。
优选的，步骤(3)所述喂食采用桑叶、蒲公英叶、柘树叶、生菜叶中的任意一种。
优选的，步骤(5)所述干燥的温度为40-50℃，干燥时间为24-30h。
所述的PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar Medium。其做法是：称取200g洗净去皮的马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20—30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再根据实验需要加1—10g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，115℃灭菌20分钟后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后即得。
在本申请技术方案中，所述人工制备方法包括了球孢白僵菌孢子液制备、病原攻毒、蚕体培养、白僵蚕培养、白僵蚕成品制备的步骤，直接将白僵蚕蚕体浸泡清洗过滤，得到的滤液中含有大量的球孢白僵菌孢子，通过一级斜面培养、二级种子培养、三级扩大培养进行复壮，得到的球孢白僵菌孢子液具有较高的活性，在进行病原攻毒时毒性较强；其中，控制一级斜面培养的温度在常温条件，使菌体快速并大量繁殖，控制二级种子培养和三级扩大培养在5-10℃的低温条件下，可保证菌体的活性，同时减少杂菌率；此外，二级种子培养和三级扩大培养的培养基，其组分包括了菌体生长必须的碳源、氮源之外，还增加了磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化铁、氯化钙，提供菌体生长所需元素，同时还增加了维生素B和维生素C，二者可以提高菌体生长速度，提高孢子量，以上复配，可以在保证球孢白僵菌活性的同时，大大减少培养的周期，提高生产效率。将球孢白僵菌孢子液在制成之后的45min内喷施于家蚕的蚕体上，可保证在球孢白僵菌活性较高的情况下攻毒，提高病原攻毒的有效率；控制较常温低的攻毒温度和较高的攻毒湿度，保证蚕体此时最易被侵染；病原攻毒之后需要对蚕体进行继续培养，每隔3-4h喂食一次，喂食的食物采用桑叶、蒲公英叶、柘树叶、生菜叶中的任意一种，能够促进蚕体在侵染之后继续发育，提高白僵蚕成品的质量；蚕体培养致死后，需要及时将其挑拣出，转移至白僵菌生长适宜的条件下培养，控制温度在25-28℃，并控制较高的湿度95-98％，使死亡蚕体上白僵菌迅速生长，加快蚕体僵化，以及分生孢子的生成；分生孢子生成之后需要将其干燥至水分小于10％，避免杂菌污染后的腐烂，另外，在干燥时需控制干燥的温度在40-50℃之间，避免温度过高，此外干燥时间应控制在24-30h，同时避免热风干燥。
与现有技术相比，本申请技术方案所述的白僵蚕的人工制备方法，其采用的球孢白僵菌孢子液经过复壮，提高了攻毒活性，僵化率高，通过攻毒、蚕体培养、白僵蚕培养过程中温度、湿度等条件的改进，缩短了白僵蚕成品的制备周期，提高了白僵蚕的产量和质量。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例所述的一种白僵蚕的人工制备方法，包括以下步骤：
(1)球孢白僵菌孢子液的制备：用无菌水浸泡、清洗白僵蚕蚕体，过滤后取滤液，经过一级斜面培养、二级种子培养、三级扩大培养后得球孢白僵菌孢子液，所述一级斜面培养的温度为26℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的温度为6℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的培养基，其组分按重量百分比计包括：PDA培养基，补充18％马铃薯淀粉、15％蔗糖、12％蛋白胨、0.3％磷酸二氢钾、0.02％硫酸镁、12％蚕蛹粉、0.03％维生素B、0.02％维生素C、0.08％氯化铁、0.06％氯化钙；
(2)病原攻毒：步骤(1)所述球孢白僵菌孢子液的浓度为5.5万个/cm3，其在制成后的45min内，迅速喷施于5龄起蚕的蚕体，喷施的次数为4次，每次喷施的间隔时间为15min，喷施完成后密闭蚕房1.5h，其中，病原攻毒的温度为23℃，湿度为98％；
(3)蚕体培养：打开步骤(2)所述蚕房，保持温度在25℃，湿度为94％，对蚕体喂食，每隔3.5h喂食一次，直至蚕体死亡，喂食采用桑叶；
(4)白僵蚕培养：将步骤(3)死亡后的蚕体转移至蚕座上，在温度为26℃，湿度为988％的条件下继续培养至蚕体僵化，并长出白色菌丝分生孢子；
(5)白僵蚕成品制备：将步骤(4)长出白色菌丝分生孢子的白僵蚕收集后干燥，干燥的温度为45℃，干燥时间为28h，即得白僵蚕成品。
本实施例中，病原攻毒后，蚕体死亡的时间为90-100h，僵化率为90％，产量为白僵蚕1.5kg/g蚕种，水分含量为8.5％，白僵蚕成品出现玻璃口，质量好。
实施例2
本实施例所述的一种白僵蚕的人工制备方法，包括以下步骤：
(1)球孢白僵菌孢子液的制备：用无菌水浸泡、清洗白僵蚕蚕体，过滤后取滤液，经过一级斜面培养、二级种子培养、三级扩大培养后得球孢白僵菌孢子液，所述一级斜面培养的温度为25℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的温度为5℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的培养基，其组分按重量百分比计包括：PDA培养基，补充10％马铃薯淀粉、5％蔗糖、10％蛋白胨、0.1％磷酸二氢钾、0.01％硫酸镁、5％蚕蛹粉、0.01％维生素B、0.01％维生素C、0.05％氯化铁、0.05％氯化钙；
(2)病原攻毒：步骤(1)所述球孢白僵菌孢子液的浓度为4.8万个/cm3，其在制成后的45min内，迅速喷施于5龄起蚕的蚕体，喷施的次数为3次，每次喷施的间隔时间为10min，喷施完成后密闭蚕房1h，其中，病原攻毒的温度为22℃，湿度为98％；
(3)蚕体培养：打开步骤(2)所述蚕房，保持温度在24℃，湿度为94％，对蚕体喂食，每隔3h喂食一次，直至蚕体死亡，喂食采用蒲公英叶；
(4)白僵蚕培养：将步骤(3)死亡后的蚕体转移至蚕座上，在温度为25℃，湿度为95％的条件下继续培养至蚕体僵化，并长出白色菌丝分生孢子；
(5)白僵蚕成品制备：将步骤(4)长出白色菌丝分生孢子的白僵蚕收集后干燥，干燥的温度为40℃，干燥时间为24h，即得白僵蚕成品。
本实施例中，病原攻毒后，蚕体死亡的时间为120-130h，僵化率为86％，产量为白僵蚕1.2kg/g蚕种，水分含量为8.9％，白僵蚕成品出现玻璃口，质量好。
实施例3
本实施例所述的一种白僵蚕的人工制备方法，包括以下步骤：
(1)球孢白僵菌孢子液的制备：用无菌水浸泡、清洗白僵蚕蚕体，过滤后取滤液，经过一级斜面培养、二级种子培养、三级扩大培养后得球孢白僵菌孢子液，所述一级斜面培养的温度为28℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的温度为10℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的培养基，其组分按重量百分比计包括：PDA培养基，补充20％马铃薯淀粉、20％蔗糖、15％蛋白胨、0.5％磷酸二氢钾、0.05％硫酸镁、15％蚕蛹粉、0.05％维生素B、0.05％维生素C、0.1％氯化铁、0.1％氯化钙；
(2)病原攻毒：步骤(1)所述球孢白僵菌孢子液的浓度为5.8万个/cm3，其在制成后的45min内，迅速喷施于5龄起蚕的蚕体，喷施的次数为4次，每次喷施的间隔时间为20min，喷施完成后密闭蚕房1.5h，其中，病原攻毒的温度为24℃，湿度为98％；
(3)蚕体培养：打开步骤(2)所述蚕房，保持温度在25℃，湿度为95％，对蚕体喂食，每隔4h喂食一次，直至蚕体死亡，喂食采用柘树叶；
(4)白僵蚕培养：将步骤(3)死亡后的蚕体转移至蚕座上，在温度为28℃，湿度为98％的条件下继续培养至蚕体僵化，并长出白色菌丝分生孢子；
(5)白僵蚕成品制备：将步骤(4)长出白色菌丝分生孢子的白僵蚕收集后干燥，干燥的温度为50℃，干燥时间为30h，即得白僵蚕成品。
本实施例中，病原攻毒后，蚕体死亡的时间为90-95h，僵化率为90％，产量为白僵蚕1.4kg/g蚕种，水分含量为7.8％，白僵蚕成品出现玻璃口，质量好。
实施例4
本实施例所述的一种白僵蚕的人工制备方法，包括以下步骤：
(1)球孢白僵菌孢子液的制备：用无菌水浸泡、清洗白僵蚕蚕体，过滤后取滤液，经过一级斜面培养、二级种子培养、三级扩大培养后得球孢白僵菌孢子液，所述一级斜面培养的温度为28℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的温度为10℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的培养基，其组分按重量百分比计包括：PDA培养基，补充10％马铃薯淀粉、20％蔗糖、10％蛋白胨、0.5％磷酸二氢钾、0.01％硫酸镁、15％蚕蛹粉、0.01％维生素B、0.05％维生素C、0.05％氯化铁、0.1％氯化钙；
(2)病原攻毒：步骤(1)所述球孢白僵菌孢子液的浓度为4.5万个/cm3，其在制成后的45min内，迅速喷施于5龄起蚕的蚕体，喷施的次数为4次，每次喷施的间隔时间为10min，喷施完成后密闭蚕房1.2h，其中，病原攻毒的温度为22℃，湿度为98％；
(3)蚕体培养：打开步骤(2)所述蚕房，保持温度在25℃，湿度为95％，对蚕体喂食，每隔4h喂食一次，直至蚕体死亡，喂食采用生菜叶；
(4)白僵蚕培养：将步骤(3)死亡后的蚕体转移至蚕座上，在温度为28℃，湿度为98％的条件下继续培养至蚕体僵化，并长出白色菌丝分生孢子；
(5)白僵蚕成品制备：将步骤(4)长出白色菌丝分生孢子的白僵蚕收集后干燥，干燥的温度为50℃，干燥时间为30h，即得白僵蚕成品。
本实施例中，病原攻毒后，蚕体死亡的时间为95-110h，僵化率为91％，产量为白僵蚕1.4kg/g蚕种，水分含量为8.2％，白僵蚕成品出现玻璃口，质量好。
实施例5
本实施例所述的一种白僵蚕的人工制备方法，包括以下步骤：
(1)球孢白僵菌孢子液的制备：用无菌水浸泡、清洗白僵蚕蚕体，过滤后取滤液，经过一级斜面培养、二级种子培养、三级扩大培养后得球孢白僵菌孢子液，所述一级斜面培养的温度为28℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的温度为5℃，所述二级种子培养和三级扩大培养的培养基，其组分按重量百分比计包括：PDA培养基，补充20％马铃薯淀粉、5％蔗糖、15％蛋白胨、0.1％磷酸二氢钾、0.05％硫酸镁、5％蚕蛹粉、0.05％维生素B、0.01％维生素C、0.1％氯化铁、0.05％氯化钙；
(2)病原攻毒：步骤(1)所述球孢白僵菌孢子液的浓度为4.5万个/cm3，其在制成后的45min内，迅速喷施于5龄起蚕的蚕体，喷施的次数为3次，每次喷施的间隔时间为10min，喷施完成后密闭蚕房1.5h，其中，病原攻毒的温度为23℃，湿度为99％；
(3)蚕体培养：打开步骤(2)所述蚕房，保持温度在25℃，湿度为95％，对蚕体喂食，每隔4h喂食一次，直至蚕体死亡，喂食采用桑叶；
(4)白僵蚕培养：将步骤(3)死亡后的蚕体转移至蚕座上，在温度为25℃，湿度为98％的条件下继续培养至蚕体僵化，并长出白色菌丝分生孢子；
(5)白僵蚕成品制备：将步骤(4)长出白色菌丝分生孢子的白僵蚕收集后干燥，干燥的温度为50℃，干燥时间为24h，即得白僵蚕成品。
本实施例中，病原攻毒后，蚕体死亡的时间为100-110h，僵化率为88％，产量为白僵蚕1.5kg/g蚕种，水分含量为8.5％，白僵蚕成品出现玻璃口，质量好。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。