一种基于白木香细胞培养提取倍半萜的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于白木香细胞培养提取倍半萜的方法。

背景技术：

白木香（Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg）别名土沉香、女儿香、牙香树、莞香、六麻树，为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属植物，是一种热带、亚热带常绿乔木。但因过度采伐，遭到了毁灭性打击，野生白木香已所剩无几，现已被列为国家珍稀濒危三级保护植物及国家二级重点保护野生植物。

现有技术中悬浮细胞系的诱导多采用茎尖作为外植体，消毒过程不充分，会导致愈伤组织诱导存活率低，污染率高等问题。其次现有技术中采用的诱导培养基以及悬浮细胞的培养基存在诱导率较低以及悬浮细胞细胞活性较低等问题。

现有的技术方法中沉香的诱导多数在白木香树木上结合真菌、化合物等进行诱导，存在操作困难，诱导时间长等缺点。诱导获得的沉香再经过加工后提取获得沉香倍半萜，增加了成本。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种基于白木香细胞培养提取倍半萜的方法，该方法提取率高，培养周期短，操作简单化，成本低。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于白木香细胞培养提取倍半萜的方法，包括如下步骤：

（1）取材消毒：取白木香果荚作为材料，进行消毒处理，备用；

（2）无菌苗诱导：将消毒处理后的白木香果荚的种子取出，进行无菌苗的诱导培养，得到白木香无菌苗；

（3）愈伤组织诱导：将诱导出来的白木香无菌苗的幼叶取出，进行愈伤组织的诱导培养，得到白木香愈伤组织；

（4）悬浮细胞培养：将诱导出来的白木香愈伤组织取出，进行悬浮细胞培养，得到白木香悬浮细胞；

（5）共培养：取诱导的白木香悬浮细胞，处理后接入结香菌种进行共培养；

（6）提取倍半萜：白木香悬浮细胞在结香菌种的诱导下积累次生代谢产物倍半萜，提取倍半萜。

优选的，所述步骤（1）具体为：取成熟的白木香果荚作为材料，先用洗洁精水中浸泡15-25min，清洗表面污渍，流水冲洗2-4h；再用质量分数为0.08-0.12%的升汞溶液浸泡处理10-20min，无菌水冲洗3-7次，用无菌吸水纸吸干表面水分，备用。

优选的，所述步骤（2）具体为：将消毒处理过的白木香果荚的种子取出，接种在添加有0.4-0.6mg/L 6-BA的改良MS培养基中进行无菌苗的诱导培养，每个培养皿倒入18-22mL培养基接种8-10粒种子。

优选的，所述步骤（2）中，诱导培养的条件为：光照强度700-900lx，光照时间9-11h/d，温度26-28℃，培养13-17d。

优选的，所述步骤（3）中，将诱导出来的白木香无菌苗的幼叶取出，叶片大小0.4-0.6cm×0.4-0.6cm，接入在18-22mL添加有1.5-1.9mg/L NAA和1.1-1.5mg/L 6-BA的改良MS培养基中进行愈伤组织的诱导培养，培养温度23-25℃，暗培养18-22d后继代。

优选的，所述步骤（4）中，取继代5次的白木香愈伤组织用镊子夹碎后放入添加有1.5-1.9mg/L NAA、1.1-1.5mg/L KT和400.0-600.0mg/L CH的改良MS培养基中进行悬浮细胞培养，每230-270mL锥形瓶放入80-100mL培养基，接种量为1.3-1.7g，用无菌纱布过滤，取滤液进行培养，继代4次后获得细胞活性均一的培养物,得到白木香悬浮细胞。

优选的，所述步骤（4）中，悬浮细胞培养的条件为：水平震荡培养，转速100-120r/min，光照强度400-600lx，光照时间8-10h/d，温度26-28℃，培养6-8d。

优选的，所述步骤（5）具体为：取诱导的白木香悬浮细胞180-220mL加入25-35μM的茉莉酸甲酯处理20-28h后，接入结香菌种2-4g，水平震荡培养，转速100-120r/min，共培养13-17d。

优选的，所述步骤（6）具体为：白木香悬浮细胞在结香菌种的诱导下积累次生代谢产物倍半萜，精密称取于55-65℃温度下干燥至恒重的样品，回流提取，定容过滤后，得到次生代谢产物倍半萜。

优选的，所述步骤（2）-（4）中，改良MS培养基包括如下组分：

KNO₃ 900-1000mg/L

NH₄NO₃ 800-850mg/L

MgSO₄•7H₂O 170-200mg/L

KH₂PO₄ 75-95mg/L

CaCl₂•2H₂O 200-240mg/L

MnSO₄•4H₂O 10-12mg/L

ZnSO₄•7H₂O 3.8-4.8mg/L

H₃BO₃ 2.6-3.6mg/L

KI 0.40-0.44mg/L

Na₂MO₄•7H₂O 0.11-0.15mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.011-0.015mg/L

CoCL₂·6H₂O 0.011-0.015mg/L

Na₂-EDTA 35-40mg/L

FeSO₄·4H₂O 25-30mg/L

甘氨酸 1.5-2.5mg/L

盐酸吡哆醇 0.3-0.7mg/L

盐酸硫铵素 0.05-0.15mg/L

烟酸 0.3-0.7mg/L

肌酸 80-120mg/L。

更为优选的，改良MS培养基包括如下组分：

KNO₃ 950mg/L

NH₄NO₃ 825mg/L

MgSO₄•7H₂O 185mg/L

KH₂PO₄ 85mg/L

CaCl₂•2H₂O 220mg/L

MnSO₄•4H₂O 11.15mg/L

ZnSO₄•7H₂O 4.3mg/L

H₃BO₃ 3.1mg/L

KI 0.42mg/L

Na₂MO₄•7H₂O 0.13mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.013mg/L

CoCL₂·6H2O 0.013mg/L

Na₂-EDTA 37.3mg/L

FeSO₄·4H₂O 27.8mg/L

甘氨酸 2.0mg/L

盐酸吡哆醇 0.5mg/L

盐酸硫铵素 0.1mg/L

烟酸 0.5mg/L

肌酸 100mg/L。

本发明的有益效果在于：本发明的方法以白木香果荚为外植体，经消毒后，接种在萌发培养基上面诱导种子发芽，得到无菌苗。随后取无菌苗幼嫩组织进行愈伤组织诱导。接入筛选出的培养基中进行愈伤组织诱导，得到形态结构优良、活力良好的愈伤组织后。将愈伤组织放入液体培养基进行液体悬浮细胞培养，得到高效的白木香悬浮细胞系。将白木香悬浮细胞系与结香菌共同培养，在结香真菌的诱导下积累白木香次生代谢产物倍半萜。

本发明的方法中白木香外植体在不同种类及不同浓度植物激素的培养条件下进行离体培养。筛选出最佳的激素种类和浓度配比，建立高效的白木香悬浮细胞系诱导方法。随后白木香悬浮细胞系与结香菌（色二孢菌、黄绿墨耳菌）共同培养，诱导次生代谢产物的积累，为利用白木香悬浮细胞的生产和应用奠定基础。

本发明的方法具有如下优点：

1、在使用白木香果荚作为材料，消毒诱导得到愈伤组织的过程中，污染率大大降低,且愈伤组织诱导率达到了86%。

2、通过本发明选出的培养基以及诱导方法可以得到高细胞活性的白木香悬浮细胞，在结香菌种和茉莉酸甲酯处理下，可以短时间内刺激次生代谢产物的大量积累。

3、白木香悬浮细胞系与结香菌共同培养后提取次生代谢产物存在培养周期短、操作简单化、成本低等优点，共培养后其次生代谢产物的提取率达到2.3%。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

实施例1

一种基于白木香细胞培养提取倍半萜的方法，包括如下步骤：

（1）取材消毒：取成熟的白木香果荚作为材料，先用洗洁精水中浸泡15min，清洗表面污渍，流水冲洗2h；在超净工作台上用质量分数为0.08%的升汞溶液浸泡处理10min，无菌水冲洗3次，用无菌吸水纸吸干表面水分，备用。

（2）无菌苗诱导：将消毒处理过的白木香果荚用镊子把种子取出，接种在添加有0.4mg/L 6-BA的改良MS培养基中进行无菌苗的诱导培养，每个培养皿倒入18mL培养基接种8粒种子；诱导培养的条件为：光照强度700lx，光照时间9h/d，温度26℃，培养13d。

（3）愈伤组织诱导：将诱导出来的白木香无菌苗的幼叶取出，叶片大小0.4cm×0.4cm，接入在18mL添加有1.5mg/L NAA和1.1mg/L 6-BA的改良MS培养基中进行愈伤组织的诱导培养，培养温度23℃，暗培养18d后继代。

（4）悬浮细胞培养：取继代5次的白木香愈伤组织用镊子夹碎后放入添加有1.5mg/L NAA、1.1mg/L KT和400.0mg/L CH的改良MS培养基中进行悬浮细胞培养，每230mL锥形瓶放入80mL培养基，接种量为1.3g，用无菌纱布过滤，取滤液进行培养，继代4次后获得细胞活性均一的培养物,得到白木香悬浮细胞；悬浮细胞培养的条件为：水平震荡培养，转速100r/min，光照强度400lx，光照时间8h/d，温度26℃，培养6d。

（5）共培养：取诱导的白木香悬浮细胞180mL加入25μM的茉莉酸甲酯处理20h后，接入结香菌种2g，水平震荡培养，转速100r/min，共培养13d。

（6）提取倍半萜：白木香悬浮细胞在结香菌种的诱导下积累次生代谢产物倍半萜，精密称取于55℃温度下干燥至恒重的样品，回流提取，定容过滤后，得到次生代谢产物倍半萜4.8g,提取率2.3%。

所述步骤（2）-（4）中，改良MS培养基包括如下组分：

KNO₃ 900mg/L

NH₄NO₃ 800mg/L

MgSO₄•7H₂O 170mg/L

KH₂PO₄ 75mg/L

CaCl₂•2H₂O 200mg/L

MnSO₄•4H₂O 10mg/L

ZnSO₄•7H₂O 3.8mg/L

H₃BO₃ 2.6mg/L

KI 0.40mg/L

Na₂MO₄•7H₂O 0.11mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.011mg/L

CoCL₂·6H₂O 0.011mg/L

Na₂-EDTA 35mg/L

FeSO₄·4H₂O 25mg/L

甘氨酸 1.5mg/L

盐酸吡哆醇 0.3mg/L

盐酸硫铵素 0.05mg/L

烟酸 0.3mg/L

肌酸 80mg/L。

实施例2

一种基于白木香细胞培养提取倍半萜的方法，包括如下步骤：

（1）取材消毒：取成熟的白木香果荚作为材料，先用洗洁精水中浸泡20min，清洗表面污渍，流水冲洗3h；在超净工作台上用质量分数为0.10%的升汞溶液浸泡处理15min，无菌水冲洗5次，用无菌吸水纸吸干表面水分，备用。

（2）无菌苗诱导：将消毒处理过的白木香果荚用镊子把种子取出，接种在添加有0.5mg/L 6-BA的改良MS培养基中进行无菌苗的诱导培养，每个培养皿倒入20mL培养基接种9粒种子；诱导培养的条件为：光照强度800lx，光照时间10h/d，温度27℃，培养15d。

（3）愈伤组织诱导：将诱导出来的白木香无菌苗的幼叶取出，叶片大小0.5cm×0.5cm，接入在20mL添加有1.7mg/L NAA和1.3mg/L 6-BA的改良MS培养基中进行愈伤组织的诱导培养，培养温度24℃，暗培养20d后继代。

（4）悬浮细胞培养：取继代5次的白木香愈伤组织用镊子夹碎后放入添加有1.7mg/L NAA、1.3mg/L KT和500.0mg/L CH的改良MS培养基中进行悬浮细胞培养，每250mL锥形瓶放入90mL培养基，接种量为1.5g，用无菌纱布过滤，取滤液进行培养，继代4次后获得细胞活性均一的培养物,得到白木香悬浮细胞；悬浮细胞培养的条件为：水平震荡培养，转速110r/min，光照强度500lx，光照时间9h/d，温度27℃，培养7d。

（5）共培养：取诱导的白木香悬浮细胞200mL加入30μM的茉莉酸甲酯处理24h后，接入结香菌种3g，水平震荡培养，转速110r/min，共培养15d。

（6）提取倍半萜：白木香悬浮细胞在结香菌种的诱导下积累次生代谢产物倍半萜，精密称取于60℃温度下干燥至恒重的样品，回流提取，定容过滤后，得到次生代谢产物倍半萜5.0g,提取率2.4%。

所述步骤（2）-（4）中，改良MS培养基包括如下组分：

KNO₃ 950mg/L

NH₄NO₃ 825mg/L

MgSO₄•7H₂O 185mg/L

KH₂PO₄ 85mg/L

CaCl₂•2H₂O 220mg/L

MnSO₄•4H₂O 11.15mg/L

ZnSO₄•7H₂O 4.3mg/L

H₃BO₃ 3.1mg/L

KI 0.42mg/L

Na₂MO₄•7H₂O 0.13mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.013mg/L

CoCL₂·6H2O 0.013mg/L

Na₂-EDTA 37.3mg/L

FeSO₄·4H₂O 27.8mg/L

甘氨酸 2.0mg/L

盐酸吡哆醇 0.5mg/L

盐酸硫铵素 0.1mg/L

烟酸 0.5mg/L

肌酸 100mg/L。

实施例3

一种基于白木香细胞培养提取倍半萜的方法，包括如下步骤：

（1）取材消毒：取成熟的白木香果荚作为材料，先用洗洁精水中浸泡25min，清洗表面污渍，流水冲洗4h；在超净工作台上用质量分数为0.12%的升汞溶液浸泡处理20min，无菌水冲洗7次，用无菌吸水纸吸干表面水分，备用。

（2）无菌苗诱导：将消毒处理过的白木香果荚用镊子把种子取出，接种在添加有0.6mg/L 6-BA的改良MS培养基中进行无菌苗的诱导培养，每个培养皿倒入22mL培养基接种10粒种子；诱导培养的条件为：光照强度900lx，光照时间11h/d，温度28℃，培养17d。

（3）愈伤组织诱导：将诱导出来的白木香无菌苗的幼叶取出，叶片大小0.6cm×0.6cm，接入在22mL添加有1.9mg/L NAA和1.5mg/L 6-BA的改良MS培养基中进行愈伤组织的诱导培养，培养温度25℃，暗培养22d后继代。

（4）悬浮细胞培养：取继代5次的白木香愈伤组织用镊子夹碎后放入添加有1.9mg/L NAA、1.5mg/L KT和600.0mg/L CH的改良MS培养基中进行悬浮细胞培养，每270mL锥形瓶放入100mL培养基，接种量为1.7g，用无菌纱布过滤，取滤液进行培养，继代4次后获得细胞活性均一的培养物,得到白木香悬浮细胞；悬浮细胞培养的条件为：水平震荡培养，转速120r/min，光照强度600lx，光照时间10h/d，温度28℃，培养8d。

（5）共培养：取诱导的白木香悬浮细胞220mL加入35μM的茉莉酸甲酯处理28h后，接入结香菌种4g，水平震荡培养，转速120r/min，共培养17d。

（6）提取倍半萜：白木香悬浮细胞在结香菌种的诱导下积累次生代谢产物倍半萜，精密称取于65℃温度下干燥至恒重的样品，回流提取，定容过滤后，得到次生代谢产物倍半5.2g,提取率2.5%。

所述步骤（2）-（4）中，改良MS培养基包括如下组分：

KNO₃ 1000mg/L

NH₄NO₃ 850mg/L

MgSO₄•7H₂O 200mg/L

KH₂PO₄ 95mg/L

CaCl₂•2H₂O 240mg/L

MnSO₄•4H₂O 12mg/L

ZnSO₄•7H₂O 4.8mg/L

H₃BO₃ 3.6mg/L

KI 0.44mg/L

Na₂MO₄•7H₂O 0.15mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.015mg/L

CoCL₂·6H₂O 0.015mg/L

Na₂-EDTA 40mg/L

FeSO₄·4H₂O 30mg/L

甘氨酸 2.5mg/L

盐酸吡哆醇 0.7mg/L

盐酸硫铵素 0.15mg/L

烟酸 0.7mg/L

肌酸 120mg/L。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。