本发明涉及一种具有杀灭松材线虫活性的独活提取物制备方法及其应用，属于林业病虫害防治技术领域。
背景技术：
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松材线虫病，又称松萎蔫病(Pine wilt disease，PWD)，是一种极具毁灭性的松树病害,松树一经感染，蔓延迅速，涉及数十种松属植物，世界多个国家存在疫情。我国内地于1982年在南京中山陵园风景区首次发现松材线虫病，现已扩展至江苏、安徽、浙江、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、重庆、四川、贵州、云南、陕西等16个地区，蔓延迅速，发生面积不断扩大，危害程度不断加重，对我国的松树资源、自然景观和生态环境构成了严重威胁。
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是松材线虫病主要的病原，松材线虫的防控对于控制松材线虫病至关重要。目前防控松材线虫最直接、有效的杀线虫剂主要是广谱性合成药剂，线虫易产生耐药性，且存在高毒、高残留、污染环境、对非靶标有益生物构成威胁等缺陷，这使得生态友好的天然杀线剂的开发显得尤为迫切。
自然界植物资源丰富，植物源杀线剂近些年一直是松材线虫病研究的热点。独活是伞形科植物重齿毛当归(Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan)的干燥根，是我国的传统中草药，湖北、四川、陕西为主要栽培地，现有多处有大规模种植基地，来源丰富。独活可用于风寒湿痹、腰膝疼痛、少阴伏风头痛、四肢麻痹等病症的治疗，我们在对独活生物活性成分的研究过程中发现，一种提取物具有很强杀的松材线虫活性。国内外还未见有关于独活提取物对松材线虫有杀灭活性的报道。
本发明首次公布了独活提取物在杀灭松材线虫中的应用，以期为新型天然植物源松材线虫防治药物的开发奠定一定的基础。
技术实现要素：
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本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有杀灭松材线虫活性的独活提取物制备方法及其应用。独活提取物具有强烈的杀松材线虫的活性，安全低毒，提取方法简单，成本低廉，其中的主要杀松材线虫活性成分确定，可为仿生合成获得更高活性的天然衍生物提供化学结构模型。
为了实现上述发明目的，本发明以粉碎的独活干粉为原料，经溶剂浸提、减压浓缩、有机溶剂萃取等方法得到一种独活的提取物，在1mg/mL浓度下能有效杀灭松材线虫。本发明方法按照如下步骤操作：
第一步，取干燥的独活于植物粉碎机中粉碎得独活干粉，加入无水乙醇室温下超声波震荡辅助避光浸提48小时，其中，独活干粉与乙醇料液比为50:1(g/L)，然后真空过滤去渣，得乙醇提取液，重复提取一次，合并提取液；
第二步，提取液采用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩得棕色乙醇粗提物；
第三步，乙醇粗提物经体积比为1：1的乙酸乙酯-水分液萃取三次，合并乙酸乙酯相；
第四步，减压蒸馏，获得具有强杀松材线虫活性的独活提取物。
取以上所得独活提取物适量，采用5％的二甲基亚砜(DMSO)溶液(含0.5％TritonX-100)溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液，取50μL，加入到24孔板相应的孔中，再加入50μL线虫悬浮液，混匀，以5％的DMSO溶液(含0.5％TritonX-100)为对照，置于26℃培养箱中避光培养，分别于24小时,48小时,72小时后取出，在体式显微镜下观察线虫存亡情况(线虫僵直并以解剖针触动无反应确定为死亡状态)，根据如下公式计算各处理线虫的校正死亡率：
结果表明这种独活提取物在1mg/mL浓度下72小时后对松材线虫的校正死亡率达95.27％。
以上得到的具有杀松材线虫活性的独活提取物进行硅胶柱层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱(石油醚：乙酸乙酯体积比＝15:1，10:1,9:1,8:1,6:1,5:1,4:1,2:1,1:1,1:3,1:4；1:6,1:8,1:10,100％乙酸乙酯)，洗脱组分经硅胶薄层层析(GF254)检测，合并相同组分，得到10个组分：Fr.1-Fr.10，经杀线活性测试确定F5和F6为高活性组分(1mg/mL，72小时校正死亡率>50％)；对两组分进一步分离纯化，F5组分再进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(8:1，v/v)洗脱，得到两个组分，分别于石油醚-乙酸乙酯中重结晶得香豆素类化合物蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯；F6组分经再次硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(6:1，v/v)洗脱，得到两组分，分别于石油醚-乙酸乙酯中重结晶得香豆素类化合物佛手柑内酯和花椒毒素。
蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、佛手柑内酯、花椒毒素这4种香豆素类化合物，化学结构式分别为：
蛇床子素的特征常数为：无色到白色针状晶体(石油醚-乙酸乙酯)，EIMS(m/z):244[M·]+,1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.26(1H，d，H-3)，7.63(1H，d，H-4)，7.29(1H，t，H-5)，6.85(1H，d，H-6)，3.94(3H，s，OCH3)，5.24(1H，m，H-2，)，3.56(2H，d，H-1’),1.84(3H，s，H-4’)，1.67(3H，s，H-5’)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ160.30(C-2)，113.08(C-3)，143.68(C-4)，126.18(C-5)，107.40(C-6)，161.32(C-7)，107.40(C-8)，152.93(C-9)，118.14(C-10)，21.97(C-1’)，121.1(C-2’)，132.64(C-3’)，25.76(C-4’)，17.93(C-5’)，56.08(OCH3)。
二氢欧山芹醇当归酸酯的特征常数为：白色晶体(乙酸乙酯)，EIMS(m/z):328[M·]+；1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.23(1H，d,H-3)，7.65(1H，d，H-4)，7.28(1H，d，H-5)，6.76(1H，d，H-6)，5.14(1H，dd，H-2’)，3.40(2H，t，H-3’)，1.66(3H，s，H-5’)，1.60(3H，s，H-6’)，5.99(1H，dd,H-8’)，1.69(3H，s，H-10’),1.90(3H，dd,H-11)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ161.00(C-2)，112.23(C-3)，143.95(C-4)，128.82(C-5)，106.66(C-6)，164.05(C-7)，112.23(C-8)，151.34(C-9)，113.57(C-10)，89.30(C-2’)，27.67(C-3’)，82.07(C-4’)，21.25(C-5’)，22.36(C-6’)，167.12(C-7’)，128.74(C-8’)，137.53(C-9’)，15.59(C-10’)，20.5(C-11’)。
佛手柑内酯的特征常数为：白色微针状晶体(乙酸乙酯)，EIMS(m/z):216[M·]+,1H NMR(500MHz,CDCl3):δ4.27(3H,s,OCH3),6.27(1H,d,J＝9.8Hz,H-3),7.03(1H,d,J＝2.4Hz,H-3’),7.13(1H,s,H-8),7.60(1H,d,J＝2.4Hz,H-2’),8.15(1H,d,J＝9.8Hz,H-4).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ60.01(C-OCH3),93.90(C-8),105.09(C-3’),106.43(C-10),112.58(C-3),112.72(C-6),139.39(C-4),144.88(C-2’),149.50(C-5),152.73(C-9),158.31(C-7),161.4(C-2)。
花椒毒素的特征常数为：无色到白色针晶(乙酸乙酯)，EIMS(m/z):216[M·]+,1H NMR(500MHz,CDCl3):δ6.39(1H,d,H-3)，7.78(1H,d,H-4)，7.37(1H，s，H-5)，4.32(3H,s,OCH3)，6.84(1H,d,H-2’)，7.71(1H,d,H-3’)；13C NMR(125MHz,CDCl3):δ160.41(C-2)，114.84(C-3)，144.27(C-4)，112.91(C-5)，126.16(C-6)，147.81(C-7)，132.92(C-8)，143.13(C-9)，116.58(C-10)，61.35(OCH3)，146.65(C-2’)，106.74(C-3’)。
将从独活提取物中分离得到的4种香豆素类化合物蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、佛手柑内酯、花椒毒素分别采用5％的二甲基亚砜(DMSO)溶液(含0.5％TritonX-100)配成200-1000μM的梯度浓度溶液，按照以上独活提取物的杀松材线虫活性测试方法进行活性测试，获得各试液对松材线虫72小时的校正死亡率，通过SPSS 17.0数据处理软件进行统计分析，结果显示蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、佛手柑内酯和花椒毒素72小时内对松材线虫的半致死浓度LC50分别为：489.17μM、406.74μM、430.08μM和435.66μM，都具有明显的杀松材线虫的活性。
本发明操作方法简单，原料来源便捷，成本低廉，高效低毒，安全环保，独活提取物在控制松材线虫病方面具有开发潜力，可应用于杀松材线虫的天然制剂。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1、杀灭松材线虫的独活提取物的制备
将干燥的独活50g于植物粉碎机中粉碎，加入无水乙醇1L室温下超声波振荡辅助避光浸提48小时，真空过滤去渣，得乙醇提取液，重复提取一次，合并提取液，提取液采用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩得棕色乙醇粗提物6.3g；乙醇粗提物经乙酸乙酯(1L)和蒸馏水(1L)分液萃取3次，乙酸乙酯相合并后减压浓缩至约2.5g，得独活的乙酸乙酯提取物。
实施例2、独活提取物的杀松材线虫活性测定
将独活的乙酸乙酯提取物采用5％的DMSO溶液(含0.5％TritonX-100)溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液，取50μL加入到24孔板相应的孔中，再分别加入50μL线虫悬浮液(约2条/μL)，混匀，以5％的DMSO溶液(含0.5％TritonX-100)为对照，每处理4个重复。置于26℃培养箱中避光培养，分别于24小时,48小时,72小时后取出，在体式显微镜下观察线虫存亡情况(线虫僵直并以解剖针触动无反应确定为死亡状态)根据如下公式计算各处理线虫的校正死亡率：
结果显示，独活提取物在1mg/mL浓度下72小时后对松材线虫的校正死亡率达95.27％，具有强杀松材线虫活性。
实施例3、独活提取物中杀松材线虫活性成分的分离
将独活的乙酸乙酯萃取物2.5g进行硅胶柱层析(200-300目，200g)，采用石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱(石油醚：乙酸乙酯体积比＝15:1，10:1,9:1,8:1,6:1,5:1,4:1,2:1,1:1,1:3,1:4；1:6,1:8,1:10,100％乙酸乙酯)，洗脱组分经硅胶薄层层析(GF254)检测，合并相同，得到10个组分：Fr.1-Fr.10，经杀线活性测试确定F5和F6为高活性组分(1mg/mL，72小时校正死亡率>50％),对两组分进一步分离纯化；F5组分再进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(8:1，v/v)洗脱，得到两个组分，分别于石油醚-乙酸乙酯中重结晶得香豆素类化合物蛇床子素(73mg)和二氢欧山芹醇当归酸酯(11mg)；F6组分经再次硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(6:1，v/v)洗脱，得到两组分，分别于石油醚-乙酸乙酯中重结晶得香豆素类化合物佛手柑内酯(7mg)和花椒毒素(3mg)。
实施例4、从独活提取物中分离得到的4种香豆素类化合物杀松材线虫活性测试
将4种从独活的乙酸乙酯萃取物中分离得到的香豆素类化合物蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、佛手柑内酯及花椒毒素分别采用5％的二甲基亚砜(DMSO)溶液(含0.5％TritonX-100)配成200-1000μM的梯度浓度溶液，按照以上独活提取物的杀松材线虫活性测试方法进行活性测试，获得各试液对松材线虫72小时的校正死亡率，通过SPSS 17.0数据处理软件进行统计分析。
结果显示，蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、佛手柑内酯和花椒毒素对松材线虫72小时的半致死浓度LC50分别为：489.17μM、406.74μM、430.08μM和435.66μM。