本发明属于植物培养
技术领域：
，具体涉及长梗黄精组织培养与快速繁殖的方法。
背景技术：
：长梗黄精(PolygonatumfilipesMerr.)，为百合科黄精属多年生草本植物，分布于江苏、安徽、浙江、江西、湖南、福建、广东(北部)，生于林下、灌丛或草坡的阴湿肥沃土壤中，因其根状茎在当地以黄精入药而大量种植，同时也可食用。目前在生产中长梗黄精的繁殖采用种子和根状茎，主要以根状茎为主，存在着繁殖系数低、繁殖周期长的缺点，因此建立长梗黄精的组培快繁体系，是实现其产业化生产的又一有效途径。目前对于百合科黄精属开展的组织培养主要集中于长梗黄精和黄精，采用的外植体主要为根状茎或由根状茎产生的芽。由于根状茎生长于地下，表面带有很多杂菌，且还存在内生菌，故其污染率的控制相对较难，此外消毒后需要较长时间才能诱导出不定芽。基本上所有黄精属植物组织培养的报道采用的最佳基本培养基均是不同浓度的MS培养基，其中诱导生根前的过程主要采用MS培养基，也有采用1/2MS进行不定芽诱导的报道；诱导生根时主要采用1/2MS培养基，也有采用MS培养基的和1/3MS培养基。黄精属不定芽的诱导甚至愈伤组织的诱导经常用到了细胞分裂素6-BA，多篇文献报道6-BA使用的最佳浓度为4.0mg/L；生根培养中单独使用生长素或其组合，甚至有2，4-D可促进生根的报道。目前长梗黄精的组织培养和快速繁殖尚未见报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种成活率高，利于实现产业化生产的长梗黄精组织培养与快速繁殖的方法。为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：一种长梗黄精组织培养与快速繁殖的方法，该方法包括以下步骤：(1)长梗黄精花蕾的消毒和接种于当年5月取尚未开花的长梗黄精的花蕾，放入冰箱4℃低温冷藏0-48h，取出后加入适量的洗洁精溶液浸泡2min，用流水冲洗0.5-1.0h后，在超净台里将茎段转入70％的酒精溶液中浸泡1min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80，质量分数为0.1％的HgCl2溶液内浸泡消毒9-10min，然后用无菌水充分浸洗3次，得到消毒完的外植体材料。(2)丛生芽的诱导将上一步得到的外植体材料放到无菌滤纸上，切去头尾，去除雄蕊和雌蕊，将花瓣切成2cm2大小，接于添加TDZ0-2.0mg/L，NAA0-1.0mg/L，AC0-2.0g/L的MS基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下灭菌20min，下同。接好花瓣的培养基置先于黑暗中培养0-7d，培养温度为28±2℃；随后转入光照培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；(3)不定芽的增殖将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3个不定芽的芽块，接种到添加有TDZ0-2.0mg/L，6-BA0-5.0mg/L，CH0-1.0mg/L，AC0-2.0g/L的MS基本培养基中进行培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；(4)再生植株的生根培养切取叶片嫩绿、生长旺盛且叶片3-4枚的不定芽，插入添加有6-BA0-4.0，NAA0-2.0mg/L，香蕉泥0-150g/L的12.5％-100％浓度的MS基本培养基中生根，培养基中添加的蔗糖为20-30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH5.8-6.0，并曾于121℃下灭菌20min；(5)炼苗移栽待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过5cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，于6h后半挪开瓶盖，并添加无菌水，再过18h，移走瓶盖，让30-40μmol/(m2·s)光强的灯光直照再生植株培养2d，期间加无菌水若干次。然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用流水小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于曾消毒过的珍珠岩，菜园土重量比为1：100-200)的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在24-28℃之间。3d后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开后即可带土移栽至大田。作为优选方案：所述步骤(1)中接种的材料为尚未开花的花蕾，并于冰箱4℃低温冷藏12-24h。作为优选方案：所述步骤(2)中的MS培养基添加有TDZ0.5mg/L，NAA0.2mg/L，AC0.5-1.0mg/L，在接种完花瓣后于黑暗中培养3-5d后再转入光照培养。作为优选方案：所述步骤(3)中MS培养基添加有TDZ0.05mg/L，6-BA2.0mg/L，CH0.3-0.4g/L，AC0.5-1.0mg/L。作为优选方案：所述步骤(4)中生根培养基配方为50％MS，6-BA0.2，NAA0.5mg/L，香蕉泥80-100g/L。与现有技术相比较，本发明的有益效果是：采用本发明的方法，较已经报道的文献，能够减少缩短前处理时间、外植体污染率低，缩短不定芽发生时间，从而更快获得长梗黄精再生植株，利于产业化生产。采用本发明方法，长梗黄精丛生芽的不定芽诱导率高达90.0％，不定芽数8.4，不定芽增殖倍数可达7.7，植株移栽成活率可达95％以上。本发明中缩略词：AC活性炭6-BA6-苄氨基腺嘌呤CH水解酪蛋白NAA萘乙酸TDZ噻苯隆(脱叶脲)具体实施方式实施例1一种长梗黄精组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤：(1)长梗黄精花蕾的消毒于当年5月取尚未开花的长梗黄精的花蕾，放入冰箱4℃低温冷藏12-24h，取出后加入适量的洗洁精溶液浸泡2min，用流水冲洗0.5-1.0h后，在超净台里将茎段转入70％的酒精溶液中浸泡1min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80，质量分数为0.1％的HgCl2溶液内浸泡消毒9-10min，然后用无菌水充分浸洗3次，得到消毒完的外植体材料，消毒成功率可达90％以上。(2)丛生芽的诱导将上一步得到的外植体材料放到无菌滤纸上，切去头尾，去除雄蕊和雌蕊，将花瓣切成2cm2大小，接于添加TDZ0.5mg/L，NAA0.2mg/L，AC0.5-1.0g/L的MS基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下灭菌20min，下同。接好花瓣的培养基置先于黑暗中培养3-5d，培养温度为28±2℃；随后转入光照培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；培养15d时开始出现花瓣切片有隆起，20d时可发现有不定芽丛，30d时不定芽可长到3cm左右，不定芽的诱导率达90.0％，诱导的不定芽丛的不定芽数有8.4。(3)不定芽的增殖将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3个不定芽的芽块，接种到添加有TDZ0.05mg/L，6-BA2.0mg/L，CH0.3-0.4mg/L，AC0.5-1.0g/L的MS基本培养基中进行培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；培养30d后统计，增殖倍数7.7，不定芽长势良好。(4)再生植株的生根培养切取叶片嫩绿、生长旺盛且叶片3-4枚的不定芽，插入添加有6-BA0.2，NAA0.5mg/L，香蕉泥80-100g/L的50％浓度的MS基本培养基中生根，培养基中添加的蔗糖为20-30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH5.8-6.0，并曾于121℃下灭菌20min；培养30d发现生根率可达95％以上，形成圆球体，在其上生成根，根长约6cm，粗壮，长有很多根毛。(5)炼苗移栽待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过5cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，于6h后半挪开瓶盖，并添加无菌水，再过18h，移走瓶盖，让30-40μmol/(m2·s)光强的灯光直照再生植株培养2d，期间加无菌水若干次。然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用流水小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于曾消毒过的珍珠岩，菜园土重量比为1：100-200的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在24-28℃之间。3d后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开后即可带土移栽至大田。练苗成活率和移栽成活率均达98％以上。实施例2本实施例与实施例1的区别在于步骤(1)：长梗黄精花蕾的消毒：于当年5月取尚未开花的长梗黄精的花蕾，放入冰箱4℃低温冷藏0-48h，取出后加入适量的洗洁精溶液浸泡2min，用流水冲洗0.5-1.0h后，在超净台里将茎段转入70％的酒精溶液中浸泡1min，用无菌水冲洗3次，浸入滴加有5滴吐温-80，质量分数为0.1％的HgCl2溶液内浸泡消毒9-10min，然后用无菌水充分浸洗3次，得到消毒完的外植体材料。在接种30d统计结果看出，后采用花蕾作为外植体进行消毒得到的污染率要远远低于采用根状茎作为外植体的，同时花蕾作为外植体诱导不定芽的时间也要远远快于采用根状茎为外植体的，且不定芽数上也远远高于根状茎为外植体的，而在低温预处理的比较上，同为花瓣作为外植体，污染率基本不变，但进行低温预处理后丛生芽的诱导率有了明显升高，不定芽数有少量增加。由表1可见，低温预处理24-48h有着最佳的丛生芽诱导率和不定芽数。表1不同外植体和低温预处理对污染率和丛生芽诱导的影响实施例3本实施例与实施例1的区别在于步骤(2)：丛生芽的诱导：将上一步得到的外植体材料放到无菌滤纸上，切去头尾，去除雄蕊和雌蕊，将花瓣切成2cm2大小，接于添加TDZ0-2.0mg/L，NAA0-1.0mg/L，AC0-2.0g/L的MS基本培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下灭菌20min，下同。接好花瓣的培养基置先于黑暗中培养0-7d，培养温度为28±2℃；随后转入光照培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；30d后统计发现，；TDZ浓度的不同处理显示，低浓度的TDZ(0.1mg/L)有着比TDZ0.5mg/L处理低不定芽诱导率和不定芽数，不定芽的生长也较弱，而高浓度的TDZ(2.0mg/L)处理较TDZ0.5mg/L处理稍高不定芽诱导和稍低不定芽数，不定芽的生长表现出了玻璃化现象；AC可以起着吸收有害物质的作用，然后AC添加量过多却又可吸收营养，从表2可看出适当浓度的AC有着高不定芽诱导率和不定芽数，不添加AC时由于褐化也会造成不定芽诱导率和不定芽数的下降，而过多也会降低不定芽诱导率和不定芽数，也会带来不定芽生长速度的减缓；和MS培养基相比，培养于相同激素和活性炭浓度组合的SH培养基的不定芽诱导率和不定芽数均较弱，不定芽的生长相似。故添加TDZ0.5mg/L，NAA0.2mg/L，AC0.5g/L的MS培养基有着最高的不定芽诱导率和不定芽数，且不定芽的生长最好，表现为叶色浓绿，茎高且粗壮。表2不同处理对丛生芽诱导的影响实施例4本实施例与实施例1的区别在于步骤(3)：不定芽的增殖：将步骤(2)诱导获得的不定芽丛切成2-3个不定芽的芽块，接种到添加有TDZ0-2.0mg/L，6-BA0-5.0mg/L，CH0-1.0mg/L，AC0-2.0g/L的MS基本培养基中进行培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14h光/10h暗，光照强度30-40μmol/(m2·s)；30d后统计发现，各培养基中不定芽的增殖倍数在4.5-8.6之间，但是增殖倍数差异明显，随着TDZ浓度的升高，虽然提高了增殖倍数，但是带来了严重的玻璃化，生长的叶畸形，茎也水渍化，获得的不定芽在生根培养中完全不能生根；但是和不添加TDZ的(增殖倍数4.5)相比，TDZ的存在确实促进了增殖(增殖倍数7.7)；研究还发现，CH的添加有利于不定芽的增殖，但是一定浓度以上效果不再增加。6-BA的浓度对于不定芽的增殖也有影响，低浓度的效果也弱于适当浓度的，高浓度的却又带来不定芽的玻璃化。表3综合来看，添加了TDZ0.05mg/L，6-BA2.0mg/L，CH0.4g/L，AC0.5g/L的MS基本培养基最适合不定芽的增殖。表3不同处理对不定芽增殖的影响培养基增殖倍数不定芽生长情况MS，TDZ0.05，6-BA2.0，CH0.4，AC0.57.7叶色浓绿，茎粗，生长快速快MS，TDZ0.5，6-BA2.0，CH0.4，AC0.58.6玻璃化MS，TDZ0.05，6-BA2.0，AC0.57.1叶色浓绿，茎粗，生长速度快MS，6-BA2.0，CH0.4，AC0.54.5叶色浓绿，茎粗，生长速度快MS，TDZ0.05，6-BA1.0，CH0.4，AC0.56.4叶色浓绿，茎较粗，生长速度较快实施例5本实施例与实施例1的区别在于步骤(4)：再生植株的生根培养：切取叶片嫩绿、生长旺盛且叶片3-4枚的不定芽，插入添加有6-BA0-4.0，NAA0-2.0mg/L，香蕉泥0-150g/L的12.5％-100％浓度的MS基本培养基中生根，培养基中添加的蔗糖为20-30g/L，琼脂添加量为8.0g/L，pH5.8-6.0，并曾于121℃下灭菌20min。30d时统计发现，生根率在22.5-95.0％，最早生根时间12-22d。不添加任何激素的低浓度(12.5％)的MS基本培养基生根率极低，且组培苗的生长不佳，而100％MS对于生根也不利，50％MS适宜；6-BA的添加，虽然对于生根率几无影响，但其对于组培苗地上部的生长有利，促进了地上部的生长；NAA对于生根起到了关键的作用，低浓度的NAA会导致细弱的根系，随着NAA浓度的增高，根变粗变短，故也不适当高浓度；添加AC和香蕉泥均大大增加了生根率，AC可提供根生长所需的黑暗环境，而香蕉泥还可起到促进组培苗生长的作用，可能是因为其内部具有促生长物质。综合表4，最佳的组合为50％MS，6-BA0.2mg/L，NAA0.5mg/L，香蕉泥80g/L，蔗糖浓度为20-30g/L，其生根率可达95％，根数5.6根，根粗适中，适于炼苗移栽。表4不同处理对丛生芽诱导的影响当前第1页1 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