一种米兰花组培繁殖的种质保存方法与流程

本发明涉及一种米兰花组培繁殖的种质保存方法，属于园林植物科学技术领域。

背景技术：

米兰花，（aglaiaodoratalour），又名树兰、四季米兰、碎米兰，是楝科米仔兰属常绿灌木或小乔木，米仔兰届常绿小乔木，适应温暖多湿的气候条件，成年植株需充足阳光。米兰的枝叶茂密，叶色葱绿光亮，一年内多次开花，夏秋最盛，开花时清香四溢，气味似兰花，清新幽雅、舒人新身、芳香扑鼻，具有极高的观赏价值。米兰花原产亚洲南部，现广泛种植于世界热带各地。在东南亚各国米兰花栽培极广，在我国福建、广东、广西、四川、云南等省多有分布，北方地区多用于盆栽。

米兰花除用于观赏性花卉，还具有极高的药用价值。米兰花其花枝叶可入药，具有治肠膈涨满、噎膈初起、咳嗽头昏、感冒胸闷、解醉酒、治跌损伤、风湿关节炎、肿痛等功效。在两广地区米兰花常添加至黑茶中，既可增加黑茶的甘醇度，又可提升茶的香味。米兰花还是天然香水的理想原料，既具有宜人的清香，又有一定的保健功能。米兰木质细致，是雕刻和制作家具的理想材料。因此米兰花具有非常好的应用前景。

一直以来，米兰花生产上都采用扦插等无性繁殖方式进行栽培扩繁。长期无性繁殖过程中，病毒逐代积累，从而造成米兰花品种退化严重，优良种性严重退化甚至丧失，园林观赏价值和药用价值大大降低，在生产中逐步淘汰。目前，米兰花基础性方面的研究报道比较少，仅限于栽培生产应用研究和有限的药用价值评价，对米兰花组织培养方面的研究还鲜有报道。随着米兰花市场开发的如花如荼的开展，米兰花基础性研究的必要性也越来越大，米兰花优良种质资源的保存技术也日益提上日程。

组培繁殖的种质保存是将种质资源的外植体在离体状态下采用组织培养的方式进行继代，利用设备进行贮藏保存，其好处是所占空间小，所需的人力资源少，而又能较好地保护物种及其遗传的多样性。目前米兰花组培繁殖的种质保存方法尚未建立，因此加强米兰花组织培养研究，探索建立保存时间久、稳定可靠的米兰花组培繁殖的种质保存方法对米兰花产业发展具有重要的推动价值。

技术实现要素：

本发明的目的是针对米兰花生产上长期无性繁殖造成的种性退化严重的缺陷，首次建立了一种保存时间久、稳定可靠的米兰花组培繁殖的种质保存方法。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种米兰花组培繁殖的种质保存方法，其特征在于，该种质保存方法包括以下技术步骤：

1）米兰花预处理：

将生长健壮、无病虫害的米兰花植株取材后进行根部清洗，然后将根部浸入装有0.01g/l的多氯苯甲酸溶液中，7-8℃低温黑暗预处理3-5天；

2）外植体取材、消毒与接种

将米兰花植株超纯水洗净后转入超净工作台进行无菌操作，剥去叶片，露出米兰花嫩茎，将嫩茎先用浓度为75%酒精浸泡30s，然后投入加入了数滴吐温80的0.1%升汞溶液中，表面消毒12-15m后用灭菌水冲洗3-5次，滤纸吸干，将嫩茎用灭菌解剖刀分割成0.6-0.9cm的小茎段，然后将小茎段正向接种于装有诱导培养基的三角瓶中；

3）不定芽诱导

培养室温度控制为27±1℃，光照强度控制为1500-2000lx，光周期控制为光12h/暗12h，25-35天诱导出不定芽；

4）慢生长增殖保存种质：

将不定芽接种至慢生长增殖培养基a或慢生长增殖培养基b中，然后将三角瓶转移到低温、弱光条件下缓慢生长，12个月继代接种一次，慢生长增殖培养基a和慢生长增殖培养基b继代接种交替使用，然后继续进行慢生长增殖步骤；

5）活化

当米兰花种质保存期结束，需要将米兰花不定芽恢复活性，将慢生长增殖的不定芽转接入活化培养基，然后转移到温度控制27±1℃，光照强度控制为1500-2000lx，光周期控制为光12h/暗12h，获得健壮的米兰花不定芽；

6）不定芽壮根后移栽：

将米兰花不定芽转接到壮根培养基中，控制温度为26-28℃、光照强度为2200-2600lx培养条件下生长20-25天诱导生根，然后打开培养瓶炼苗7-9天后移栽入大田。

所述步骤2）中诱导培养基配方为：ms＋2，4-d2mg/l+naa0.25mg/l+复酞核酸0.6mg/l+蔗糖40g/l+氯化2-羟乙基三甲铵0.25g/l+植物硫化激动素psk-α55pmol/l+甲基亚硝基脲1.5g/l+水解蛋白0.3g/l+活性炭1.5g/l+琼脂6.5g/l，ph5.8-6.0。

所述步骤4）中的慢生长增殖培养基a的配方为：kno32200～2600mg/l，nh4no31600～1800mg/l，kh2po4160～180mg/l，cacl2∙2h2o430～450mg/l，mgso4∙7h2o360～380mg/l，na2-edta30～35mg/l，feso4∙7h2o22～26mg/l，mnso4∙4h2o21～24mg/l，znso4∙7h2o8～9mg/l，h3bo30.1～0.2mg/l，ki0.6～0.8mg/l，肌醇90～110mg/l，甘氨酸1.8～2.2mg/l，白喉霉素0.6～0.8mg/l，维生素b10.35～0.45mg/l，维生素b60.45～0.55mg/l，蔗糖23～27g/l，甘露醇27～33g/l，植物凝胶5.2～5.8g/l，naa0.15～0.25mg/l，2，4-d0.8～1.2mg/l，调环酸钙0.9～1.1mg/l，生物素0.15～0.17mg/l，植物硫化激动素psk-α15-25pmol/l，山梨醇23～27g/l，水解蛋白0.9～1.1g/l，ph5.8-6.0；

所述的慢生长增殖培养基b的配方为：kno32200～2600mg/l，nh4no31600～1800mg/l，kh2po4160～180mg/l，cacl2∙2h2o20～30mg/l，mgso4∙7h2o360～380mg/l，na2-edta30～35mg/l，feso4∙7h2o22～26mg/l，mnso4∙4h2o21～24mg/l，znso4∙7h2o0.1～0.2mg/l，h3bo35～6mg/l，ki0.6～0.8mg/l，cuso4·5h2o0.04～0.06mg/l，na2moo4·2h2o0.15～0.2mg/l，cocl2·6h2o0.15～0.2mg/l，肌醇90～110mg/l，甘氨酸1.8～2.2mg/l，白喉霉素0.6～0.8mg/l，维生素b10.35～0.45mg/l，维生素b60.45～0.55mg/l，蔗糖23～27g/l，甘露醇27～33g/l，植物凝胶5.2～5.8g/l，naa0.15～0.25mg/l，2，4-d0.8～1.2mg/l，调环酸钙0.9～1.1mg/l，生物素0.15～0.17mg/l，植物硫化激动素psk-α15-25pmol/l，山梨醇23～27g/l，水解蛋白0.9～1.1g/l，ph5.8-6.0。

所述步骤4）中的低温、弱光条件为：培养温度控制为5-7℃，光照强度控制为400-500lx，光周期控制为光12h/暗12h。

所述步骤4）中的继代次数不超过4次。

所述步骤5）中的活化培养基的配方为：ms+2.5mg/l2，4-d+0.2mg/lnaa+植物硫化激动素psk-α30pmol/l+35g/l蔗糖+25g/l聚乙二醇+1g/l水解蛋白+5.5g/l植物凝胶，ph5.8-6.0。

所述步骤6）中的壮根培养基的配方为：1/2ms+多效唑0.08mg/l+蔗糖15g/l，ph为5.8-6.0。

本发明相比现有技术有如下优点：

（1）本发明首次建立了米兰花组培繁殖的种质保存方法，该保存方法操作简便，稳定可靠，极大节省了人力、物力和空间，为米兰花的产业推广提供了有力保障；

（2）本发明通过对米兰花组培生长的有效调控，极大延长了米兰花种质的保存时间，种质保存期可以延长到5年之久，而且优良性状保存效果好，移栽成活率高。

附图说明

附图1为采用本发明技术路线，对选材米兰花种质的照片；

附图2为采用本发明技术路线，米兰花外植体成功诱导出不定芽时的照片；

附图3为采用本发明技术路线，米兰花不定芽继代4次后（4年零10个月）的照片；

附图4为采用本发明技术路线，米兰花大田移栽后生长6个月时的照片。

具体实施方式

一种米兰花组培繁殖的种质保存方法，其特征在于，该种质保存方法的技术环节和详细步骤如下：

1）米兰花预处理：

将生长健壮、无病虫害的米兰花植株取材后进行根部清洗，然后将根部浸入装有0.01g/l的多氯苯甲酸溶液中，7-8℃低温黑暗预处理3-5天；

2）外植体取材、消毒与接种

将米兰花植株超纯水洗净后转入超净工作台进行无菌操作，剥去叶片，露出米兰花嫩茎，将嫩茎先用浓度为75%酒精浸泡30s，然后投入加入了数滴吐温80的0.1%升汞溶液中，表面消毒12-15m后用灭菌水冲洗3-5次，滤纸吸干，将嫩茎用灭菌解剖刀分割成0.6-0.9cm的小茎段，然后将小茎段正向接种于装有诱导培养基（诱导培养基配方为：ms＋2，4-d2mg/l+naa0.25mg/l+复酞核酸0.6mg/l+蔗糖40g/l+氯化2-羟乙基三甲铵0.25g/l+植物硫化激动素psk-α55pmol/l+甲基亚硝基脲1.5g/l+水解蛋白0.3g/l+活性炭1.5g/l+琼脂6.5g/l，ph5.8-6.0）的三角瓶中；

3）不定芽诱导

培养室温度控制为27±1℃，光照强度控制为1500-2000lx，光周期控制为光12h/暗12h，25-35天诱导出不定芽；

4）慢生长增殖保存种质：

将不定芽接种至慢生长增殖培养基a（慢生长增殖培养基a的配方为：kno32200～2600mg/l，nh4no31600～1800mg/l，kh2po4160～180mg/l，cacl2∙2h2o430～450mg/l，mgso4∙7h2o360～380mg/l，na2-edta30～35mg/l，feso4∙7h2o22～26mg/l，mnso4∙4h2o21～24mg/l，znso4∙7h2o8～9mg/l，h3bo30.1～0.2mg/l，ki0.6～0.8mg/l，肌醇90～110mg/l，甘氨酸1.8～2.2mg/l，白喉霉素0.6～0.8mg/l，维生素b10.35～0.45mg/l，维生素b60.45～0.55mg/l，蔗糖23～27g/l，甘露醇27～33g/l，植物凝胶5.2～5.8g/l，naa0.15～0.25mg/l，2，4-d0.8～1.2mg/l，调环酸钙0.9～1.1mg/l，生物素0.15～0.17mg/l，植物硫化激动素psk-α15-25pmol/l，山梨醇23～27g/l，水解蛋白0.9～1.1g/l，ph5.8-6.0）或慢生长增殖培养基b（慢生长增殖培养基b的配方为：kno32200～2600mg/l，nh4no31600～1800mg/l，kh2po4160～180mg/l，cacl2∙2h2o20～30mg/l，mgso4∙7h2o360～380mg/l，na2-edta30～35mg/l，feso4∙7h2o22～26mg/l，mnso4∙4h2o21～24mg/l，znso4∙7h2o0.1～0.2mg/l，h3bo35～6mg/l，ki0.6～0.8mg/l，cuso4·5h2o0.04～0.06mg/l，na2moo4·2h2o0.15～0.2mg/l，cocl2·6h2o0.15～0.2mg/l，肌醇90～110mg/l，甘氨酸1.8～2.2mg/l，白喉霉素0.6～0.8mg/l，维生素b10.35～0.45mg/l，维生素b60.45～0.55mg/l，蔗糖23～27g/l，甘露醇27～33g/l，植物凝胶5.2～5.8g/l，naa0.15～0.25mg/l，2，4-d0.8～1.2mg/l，调环酸钙0.9～1.1mg/l，生物素0.15～0.17mg/l，植物硫化激动素psk-α15-25pmol/l，山梨醇23～27g/l，水解蛋白0.9～1.1g/l，ph5.8-6.0）中，然后将三角瓶转移到培养温度控制为5-7℃、光照强度控制为400-500lx、光周期控制为光12h/暗12h的低温、弱光条件下缓慢生长，12个月继代接种一次，继代次数不超过4次，慢生长增殖培养基a和慢生长增殖培养基b继代接种交替使用，然后继续进行慢生长增殖步骤；

5）活化

当米兰花种质保存期结束，需要将米兰花不定芽恢复活性，将慢生长增殖的不定芽转接入活化培养基（活化培养基的配方为：ms+2.5mg/l2，4-d+0.2mg/lnaa+植物硫化激动素psk-α30pmol/l+35g/l蔗糖+25g/l聚乙二醇+1g/l水解蛋白+5.5g/l植物凝胶，ph5.8-6.0），然后转移到温度控制27±1℃，光照强度控制为1500-2000lx，光周期控制为光12h/暗12h，获得健壮的米兰花不定芽；

6）不定芽壮根后移栽：

将米兰花不定芽转接到壮根培养基（壮根培养基的配方为：1/2ms+多效唑0.08mg/l+蔗糖15g/l，ph为5.8-6.0）中，控制温度为26-28℃、光照强度为2200-2600lx培养条件下生长20-25天诱导生根，然后打开培养瓶炼苗7-9天后移栽入大田。

本发明提供的米兰花组培繁殖的种质保存方法可显著延长米兰花种质的保存时间，同时大大节省保存所需的劳力、物力和空间，而且操作简便，米兰花性状保存稳定可靠，移栽成活率高，移栽后米兰花植株生长健壮，有效保持了米兰花种质的优良性状，具有重要的产业推广价值。

实施例

2010年3月，在江苏省连云港市振兴花卉基地组培实验中心选择米兰花种质按照本发明的技术路线进行组培繁殖种质保存，详细步骤如下：

1）米兰花预处理：

实验中心于2002年从南方植物园引进米兰花优良种质，经过数年的试验摸索，初步建立了米兰花组培高效扩繁方法，经过数年前期试验技术的积累，2010年进行米兰花种质资源的扩繁试验，选择生长健壮、无病虫害的米兰花植株（如附图1所示）取材后进行根部清洗，然后将根部浸入装有0.01g/l的多氯苯甲酸溶液中，7.5℃低温黑暗预处理4天；

2）外植体取材、消毒与接种

将米兰花植株超纯水洗净后转入超净工作台进行无菌操作，剥去叶片，露出米兰花嫩茎，将嫩茎先用浓度为75%酒精浸泡30s，然后投入加入了数滴吐温80的0.1%升汞溶液中，表面消毒13.5m后用灭菌水冲洗4次，滤纸吸干，将嫩茎用灭菌解剖刀分割成0.6-0.9cm的小茎段，然后将小茎段正向接种于装有诱导培养基（诱导培养基配方为：ms＋2，4-d2mg/l+naa0.25mg/l+复酞核酸0.6mg/l+蔗糖40g/l+氯化2-羟乙基三甲铵0.25g/l+植物硫化激动素psk-α55pmol/l+甲基亚硝基脲1.5g/l+水解蛋白0.3g/l+活性炭1.5g/l+琼脂6.5g/l，ph5.9）的三角瓶中；

3）不定芽诱导

培养室温度控制为26-28℃，光照强度控制为1750lx，光周期控制为光12h/暗12h，一个月左右会发现有外植体普遍诱导出不定芽，如附图2所示；

4）慢生长增殖保存种质：

将不定芽接种至慢生长增殖培养基a（慢生长增殖培养基a的配方为：kno32400mg/l，nh4no31700mg/l，kh2po4170mg/l，cacl2∙2h2o440mg/l，mgso4∙7h2o370mg/l，na2-edta32.5mg/l，feso4∙7h2o24mg/l，mnso4∙4h2o22.5mg/l，znso4∙7h2o8.5mg/l，h3bo30.15mg/l，ki0.7mg/l，肌醇100mg/l，甘氨酸2mg/l，白喉霉素0.7mg/l，维生素b10.4mg/l，维生素b60.5mg/l，蔗糖25g/l，甘露醇30g/l，植物凝胶5.5g/l，naa0.2mg/l，2，4-d1mg/l，调环酸钙1mg/l，生物素0.16mg/l，植物硫化激动素psk-α20pmol/l，山梨醇25g/l，水解蛋白1g/l，ph5.9）或慢生长增殖培养基b（慢生长增殖培养基b的配方为：kno32400mg/l，nh4no31700mg/l，kh2po4170mg/l，cacl2∙2h2o25mg/l，mgso4∙7h2o370mg/l，na2-edta32.5mg/l，feso4∙7h2o24mg/l，mnso4∙4h2o22.5mg/l，znso4∙7h2o0.15mg/l，h3bo35.5mg/l，ki0.7mg/l，cuso4·5h2o0.05mg/l，na2moo4·2h2o0.175mg/l，cocl2·6h2o0.175mg/l，肌醇100mg/l，甘氨酸2mg/l，白喉霉素0.7mg/l，维生素b10.4mg/l，维生素b60.5mg/l，蔗糖25g/l，甘露醇30g/l，植物凝胶5.5g/l，naa0.2mg/l，2，4-d1mg/l，调环酸钙1mg/l，生物素0.16mg/l，植物硫化激动素psk-α20pmol/l，山梨醇25g/l，水解蛋白1g/l，ph5.9）中，然后将三角瓶转移到培养温度控制为6℃、光照强度控制为450lx、光周期控制为光12h/暗12h的低温、弱光条件下缓慢生长，12个月继代接种一次，慢生长增殖培养基a和慢生长增殖培养基b继代接种交替使用，然后继续进行慢生长增殖步骤，米兰花不定芽继代4次后（4年零10个月）的照片如附图3所示；

5）活化

当米兰花种质保存期结束，需要将米兰花不定芽恢复活性，将慢生长增殖的不定芽转接入活化培养基（活化培养基的配方为：ms+2.5mg/l2，4-d+0.2mg/lnaa+植物硫化激动素psk-α30pmol/l+35g/l蔗糖+25g/l聚乙二醇+1g/l水解蛋白+5.5g/l植物凝胶，ph5.9），然后转移到温度控制26-28℃，光照强度控制为1750lx，光周期控制为光12h/暗12h，获得健壮的米兰花不定芽；

6）不定芽壮根后移栽：

将米兰花不定芽转接到壮根培养基（壮根培养基的配方为：1/2ms+多效唑0.08mg/l+蔗糖15g/l，ph为5.9）中，控制温度为26-28℃、光照强度为2400lx培养条件下生长23天诱导生根，然后打开培养瓶炼苗8天后移栽入大田，移栽1个月后统计移栽成活率，达到94.6%，米兰花生长良好，米兰花大田移栽后生长6个月时的照片如附图4所示。

本发明提供的米兰花组培繁殖的种质保存方法可显著延长米兰花种质的保存时间，同时大大节省保存所需的劳力、物力和空间，而且操作简便，米兰花性状保存稳定可靠，移栽成活率高，移栽后米兰花植株生长健壮，有效保持了米兰花种质的优良性状，具有重要的产业推广价值。

本领域技术人员可以根据本发明公开的内容和所掌握的本领域技术对本发明内容作出替换或变型，但是这些替换或变型都不应视为脱离本发明构思的，这些替换或变型均在本发明要求保护的权利范围内。