一种牙周膜干细胞的冻存液及其冻存方法与流程

本发明属于细胞冻存领域，尤其涉及一种牙周膜干细胞的冻存液及其冻存方法。
背景技术：
：牙周疾病不仅是引起成年人失牙的主要原因，还是危害人类口腔乃至全身健康的主要口腔疾病。牙周病是牙周组织的慢性炎症刺激下的感染性疾病，是牙菌斑中的微生物在相应的微环境下引起的炎症，它损坏牙周组织，尤其是牙槽骨的破坏和牙周组织的丧失，最终导致牙齿松动脱落以及牙槽骨的吸收。而牙周治疗的目标就是要治疗牙周炎症，改善微环境重新再生出新的结缔组织附着和支持组织，完成牙槽骨，牙骨质和牙周膜的构建。常用的牙周再生方法有引导组织再生术、根面平整术等，此类方法简单易行但并不能完全实现功能性和结构性牙周组织再生，存在相应的局限性。牙周组织工程技术的出现和发展为牙周再生提供了崭新的思路和方法。牙周膜是牙根与牙槽骨之间的一层结缔组织，是重要的牙周支持组织，主要由成纤维细胞、成牙骨质细胞和一些未分化的间充质细胞组成。正常情况下，牙周组织具有自身的更新和修复能力，其修复活动是通过牙周膜细胞自我更新实现的。在疾病或在受到外界刺激时，通过牙周膜中细胞的不断增殖和分化使组织再生。2004年seo等从拔除的第三磨牙牙周膜组织中分离得到牙周膜干细胞(periodontalligamentsemcells，pdlscs)。此外，在拔牙后牙槽窝的内表面也有pdlscs存在。近来，有人从成人牙周组织中得到了高度纯化的pdlscs克隆。值得注意的是，更多研究发现，从炎症牙周膜组织中也可分离得到pdlscs，并证明其仍保持再生牙骨质和牙周膜组织的潜能，也在一定程度弥补了其来源不足的弊端。研究表明，pdlscs表达间充质干细胞的标记物stro-1和cd146/muc18，这意味着pdlscs很有可能是来源于血管周围的细胞群。而这一点恰恰与同样表达stro-1和cd146/muc18的骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，bmmscs)非常相似。pdlscs也具有与bmscs相似的多向分化能力，可体外分化为多种细胞，如脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等，在维持牙周组织的稳态，维护牙槽骨的新陈代谢过程中发挥了重要作用。虽然有研究采用包括脂肪、骨髓在内的多种组织来源的成体干细胞进行牙周再生，但取材的有创性和伦理性等问题仍然制约了其发展。因此，pdlscs有望成为牙周组织再生的首选种子细胞。近几年，干细胞库建立的需要以及临床上对干细胞的需求增加，对干细胞冻存与复苏方面的研究引起了越来越多的关注。与其他来源mscs一样，pdlscs作为组织工程学研究和潜在临床应用的种子细胞，其过度传代会表现明显衰老或凋亡，且长期体外培养易发生自发分化，失去多分化潜能，增殖、黏附能力下降，细胞凋亡率增加，所以冻存pdlscs也是其研究应用的重要环节之一。细胞冻存液是一种细胞冻存时使用的溶液，它可以供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时可以防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。目前常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常是由二甲基亚砜(dimathylsulfoxide，dmso)和胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)混合组成。dmso是一种分子量小，且具有强溶解能力和渗透能力的化学物质。在许多研究中，dmso是最常用的细胞冻存保护剂，用其保存的细胞复苏后与新鲜细胞比较，具有相似的表型、细胞表面标记及生长速率。dmso的作用机制是在降温过程中透过细胞膜进入细胞内，降低细胞内、外未结冰溶液中电解质浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质损伤，同时细胞内水分不会过度外渗，避免细胞过度脱水皱缩。然而，dmso对细胞有一定毒性作用，浓度过高会引起较高的渗透压，不利于细胞复苏。因此，目前dmso常规使用浓度为5％-15％。fbs属于异源性物质，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果。综上所述，传统的细胞冻存液会对牙周膜干细胞产生毒性和免疫原性反应，因此，研发一种不对牙周膜干细胞产生细胞毒性、免疫原性，还能显著提高细胞冻存后复苏活率的冻存液是本领域技术人员亟待解决的技术问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种牙周膜干细胞的冻存液及其冻存方法，能有效解决传统冻存液对牙周膜干细胞产生毒性和免疫原性反应导致的冻存效果差，复苏后细胞活率低的技术缺陷。本发明提供的一种牙周膜干细胞的冻存液，包括甘油、间充质干细胞无血清培养液和人血白蛋白。作为优选，所述冻存液包括：甘油的体积百分含量为10％、间充质干细胞无血清培养液的体积百分含量为30-60％、人血白蛋白的体积百分含量为30-60％。作为优选，所述冻存液包括：甘油的体积百分含量为10％、间充质干细胞无血清培养液的体积百分含量为40％、人血白蛋白的体积百分含量为50％。作为优选，所述人血白蛋白质量浓度为20％。进一步的，本发明还公开了一种牙周膜干细胞冻存方法，包括以下步骤：向牙周膜干细胞中加入所述冻存液，混匀后冻存。作为优选，冻存液的加入量为至牙周膜干细胞密度为1.0×106个/ml-5×106个/ml。作为优选，所述冻存具体为所述冻存液与所述牙周膜干细胞混匀后分装到冻存管内，放入提前恢复室温的程序降温盒后，放置-80℃超低温冰箱，2-3天后转移到液氮保存。本发明公开一种牙周膜干细胞冻存液，包括甘油、间充质干细胞无血清培养液和人血白蛋白。通过甘油、间充质干细胞无血清培养液和人血白蛋白三者的协同作用。其中，甘油可作为渗透性冷冻保护剂，细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩；间充质干细胞无血清培养液和人血白蛋白可维持细胞正常渗透压，保持细胞膜完整性，维持正常ph值以及保护细胞膜表面蛋白功能正常。本发明可大大提高了细胞膜对水的通透性，可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。此冻存液不含dmso，避免了其对细胞的毒害作用，同时不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。同时，本发明的牙周膜干细胞冻存液及冻存方法能保持冻存牙周膜干细胞的活性，复苏后牙周膜干细胞活率显著提高，而且不影响细胞表面标记物的表达，并不影响其分化潜能，特别是分化成成脂细胞和成骨细胞的潜能。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示牙周膜干细胞表面标志物表达率图；图2示采用实施例复苏细胞的细胞复苏结果及细胞活率统计；图3示采用对比例培养的细胞生长曲线图；图4示采用实施例3培养的细胞生长曲线；图5示采用对比例和实施例3培养的细胞生长形态图像(左边栏为对比例，右边栏为实施例3，第1、2、3横行为第一、二、三天细胞生长图)；图6示采用对比例和实施例3培养的细胞生长形态图像(左边栏为对比例，右边栏为实施例3，第1、2、3横行为第四、五、六天细胞生长图)；图7示采用对比例和实施例3培养的细胞生长形态图像(左边栏为对比例，右边栏为实施例3，第1横行为第七天细胞生长图)；图8示实施例3的pdlscs表面标志物表达率图；图9示对比例与实施例3成骨分化效果图(200×)；图10示对比例与实施例3成脂分化效果图(200×)。其中，图1和图8横坐标中的cd146-a、cd105-a、cd73-a、hla-dr-a、cd34-a、cd45-a为表面抗原cd146、cd105、cd73、hla-dr、cd34、cd45，纵坐标为抗原表达率。具体实施方式本发明提供了一种牙周膜干细胞冻存液和冻存方法，能有效解决传统冻存液对牙周膜干细胞产生毒性和免疫原性反应导致的冻存效果差，复苏后细胞活率低的技术缺陷。下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。其中，本发明所用间充质干细胞无血清培养液为市售产品：lonza12-725f，ultracultureserum-freemedium(sfm)。实施例1对pdlscs进行原代分离培养、鉴定及传代。pdlscs进行原代分离培养，包括以下步骤：1、取材：取12-18岁健康供者的因正畸需要拔除的第3磨牙，快速浸入已经4℃预冷含3倍体积的双抗的pbs中。2、漂洗：用含3倍双抗的pbs从牙根到牙冠的方向冲洗牙体，彻底清除血污，重复3次。3、牙周组织刮取：用手术刀片冠根单向刮取根中下1/3段的牙周膜组织，移入离心管，并用眼科剪将组织块剪成约为1mm3大小。4、消化：加入适量胶原酶-dispase酶1:1混合消化液(胶原酶3g/l，dispase酶4g/l)，置37℃恒温摇床中消化30-35min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量pbs重悬，1000r/min离心5min，弃上清。5、接种：加入培养液(含体积分数10％fbs的dmem培养液)重悬细胞，接种于六孔板，5％co2培养箱37℃培养。6、纯化：待细胞长满细胞平板面积的80％-90％后，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞，将收集的细胞与stro-1单抗在4℃孵育1h后，与磁珠混合4℃孵育30min，在磁力设备作用下筛选出stro-1和pdlscs，pdlscs接种于新的六孔板中，在5％co2培养箱37℃培养。对pdlscs进行鉴定，包括以下步骤：待细胞长满平板面积的80-90％后，收集细胞(约1×106个)，加入3g/ltriton浸泡20min后，pbs洗3遍，10％山羊血清室温封闭2h，分别滴加1:200稀释的cd146、cd105、cd73、hla-dr、cd34、cd45抗体各50μl，同时对照组(不孵育抗体的阴性组)滴加纯pbs50μl，4℃处理16h，次日室温放置30min，pbs漂洗3遍，各组分别滴加1:500稀释的fitc标记二抗igg，常温避光孵育1h，pbs漂洗2遍，10％福尔马林固定细胞，流式细胞仪测定抗原的阳性率。结果显示，与对照组相比，分离的pdlscs表面抗原cd146、cd105、cd73表达阳性，而hla-dr、cd34、cd45表达阴性，说明从牙齿中成功分离到pdlscs。表1pdlscs细胞表面标志物表达率细胞表型cd146cd105cd73hla-drcd34cd45阳性表达率(％)99.8099.8099.800.200.200.30pdlscs传代，包括以下步骤：待鉴定结果为阳性的pdlscs铺板，长满平板面积的80-90％后，用吸管吸弃旧培养液，加入0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入含10％体积百分比fbs的dmem培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入含10％体积百分比fbs的dmem培养液，进行细胞记数，按5×104个/ml密度接种于培养皿中进行传代培养，5％co2培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。对比例对比例冻存液的配制：将冻存液体积百分含量为10％的dmso、冻存液体积百分含量为90％的fbs混合后制得对比例的冻存液，于4℃冰箱冷藏备用。实施例2实施例2冻存液的配制：将实施例2冻存液的体积百分含量为10％的甘油、实施例2冻存液的体积百分含量为30％的间充质干细胞无血清培养液和实施例2冻存液的体积百分含量为60％的人血白蛋白(人血白蛋白质量浓度为20％)，混合后制得实施例2的冻存液，于4℃冰箱冷藏备用。实施例3实施例3冻存液的配制：将实施例3冻存液的体积百分含量为10％的甘油、将实施例3冻存液的体积百分含量为40％的间充质干细胞无血清培养液和将实施例3冻存液的体积百分含量为50％的人血白蛋白(人血白蛋白质量浓度为20％)，混合后制得实施例3的冻存液，于4℃冰箱冷藏备用。实施例4实施例4冻存液的配制：将体积百分含量为10％的甘油、体积百分含量为50％的间充质干细胞无血清培养液和体积百分含量为40％的人血白蛋白(人血白蛋白质量浓度为20％)，混合后制得实施例4的冻存液，于4℃冰箱冷藏备用。实施例5实施例5冻存液的配制：将将实施例3冻存液的体积百分含量为10％的甘油、将实施例3冻存液的体积百分含量为60％的间充质干细胞无血清培养液和将实施例3冻存液的体积百分含量为30％的人血白蛋白(人血白蛋白质量浓度为20％)，混合后制得实施例5的冻存液，于4℃冰箱冷藏备用。实施例6细胞冻存步骤为：1、细胞收集：选取第3代pdlscs，待细胞长满平板的80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量间充质干细胞无血清培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。2、冻存：分别用配制好的各实施例和对比例冻存液冻存细胞，冻存液加入量为至牙周膜干细胞密度为1.0×106个/ml，设置重复3次。分装到2ml冻存管内，1.5ml/管，放入提前恢复室温的程序降温盒，放置-80℃超低温冰箱，程序降温盒能保证温度以1℃/min的速度下降；2天后转移到液氮保存。实施例7对各实施例和对比例的细胞进行复苏，包括以下步骤：对比例与各实施例冻存的细胞于液氮冻存一个月后，分别取出三组重复进行细胞复苏，冻存管取出立即放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中需不断摇晃冻存管。1-2min液体融化后，用10ml间充质干细胞无血清培养基稀释细胞悬液(用培养基把冻存管洗一遍)，混匀后取0.5ml细胞悬液进行细胞计数与活性检测。实验结果显示，本发明所述pdlscs冻存液冻存效果明显优于常规细胞冻存液(表2，图2)。表2采用实施例复苏细胞的细胞复苏结果及细胞活率统计实施例8对实施例3和对比例的细胞生长曲线比较，包括以下步骤：对比例与实施例3冻存的细胞于液氮冻存一个月后，冻存管取出立即放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中需不断摇晃冻存管。1-2min液体融化后，用10ml间充质干细胞无血清培养基稀释细胞悬液(用培养基把冻存管洗一遍)，1000r/min离心5min，弃上清。用含10ng/mlegf的间充质干细胞无血清培养基重悬后，细胞按1×104个/ml密度接种于24孔板中，放入5％co2培养箱37℃培养。每天收集细胞进行细胞计数，每次随机收集计算3个重复(孔1、孔2、孔3)，连续7天，绘制细胞生长曲线。结果显示采用本发明所述人pdlscs冻存液冻存pdlscs，复苏后培养细胞生长规律正常，其增殖活性高于常规的细胞冻存液冻存pdlscs，如表3和表4、图3、图4所示。每天细胞收集前在倒置显微镜下连续观察两组细胞的生长形态并采集图像。结果如图5-图7所示。图3-图7结果均说明本发明实施例3的冻存液对细胞复苏后具有促进增殖作用。表3对比例冻存的mdscs复苏培养每天计数结果表4实施例3冻存的mdscs复苏培养每天计数结果实施例9对实施例3的细胞表面标记物测定，包括以下步骤：实施例3冻存的细胞于液氮冻存一个月后，冻存管取出立即放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中需不断摇晃冻存管。1-2min液体融化后，用10ml间充质干细胞无血清培养基稀释细胞悬液(用培养基把冻存管洗一遍)，1000r/min离心5min，弃上清。用10ml含10ng/mlegf的间充质干细胞无血清培养基重悬后，细胞接种于10cm培养皿中，放入5％co2培养箱37℃培养。48h后收集细胞，流式细胞仪检测其表面标志物cd146、cd105、cd73、hla-dr、cd34和cd45的表达情况。结果如表5和图8。检测结果表明，采用本发明所述牙周膜干细胞冻存液冻存细胞，复苏后的pdlscs表达干细胞典型的表面标记物，与冻存前pdlscs比较无显著性差异。表明本发明所述pdlscs冻存液不会影响pdlscs的细胞表面标记物的表达。表5实施例3pdlscs细胞表面标志物表达率实施例10多向分化潜能检测，包括以下步骤：对比例与实施例3冻存的细胞于液氮冻存一个月后，冻存管取出立即放入37℃水浴锅中溶解，溶解过程中需不断摇晃冻存管。1-2min液体融化后，用10ml间充质干细胞无血清培养基稀释细胞悬液(用培养基把冻存管洗一遍)，1000r/min离心5min，弃上清。用含10ng/mlegf的间充质干细胞无血清培养基重悬后，细胞按1×105个/ml密度接种于6孔板中，放入5％co2培养箱37℃培养。待细胞融合度达80％以上，位冻存过的正常牙周膜干细胞和实施例3冻存复苏后的牙周膜干细胞进行诱导成骨分化和成脂分化。14天后对两组成脂分化实验组细胞进行油红o染色，21天后对两组成骨分化实验组细胞进行茜素红染色。如图9所示，对比例的阴性对照和成脂诱导组与实施例3的阴性对照和成脂诱导组染色结果相似，图10表明对比例的阴性对照和成骨诱导组与实施例3的阴性对照和成骨诱导组染色结果相似，该实验结果表明本发明所述牙周膜干细胞冻存液不会影响pdlscs的成脂和成骨分化潜能(图9、图10)。综上所述，该发明能有效解决现有的冻存液对牙周膜干细胞冻存效果差，复苏后细胞活率低的技术缺陷。本发明的牙周膜干细胞冻存液又能很好保持冻存细胞活性，复苏后牙周膜干细胞活率显著提高，而且不影响细胞表面标记物的表达及其成脂和成骨的分化潜能。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12