一种用于提高白芷劣变种子活力的复合引发剂及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于提高白芷劣变种子活力的复合引发剂及其应用。
背景技术：
：白芷为伞形科植物白芷angelicadahurica(fisch.exhoffm.)benth.ethook.f或杭白芷angelicadahurica(fisch.exhoffm.)benth.ethook.f.var.formosana(boiss.)shanetyuan的干燥根，以根入药，其性温，气芳香，味辛、微苦，归胃、结肠、肺经，具有散风除湿、通窍镇痛、消肿排脓等功效。白芷为川产道地药材，主产于四川遂宁，在资阳、南充、泸州、达州等地零散分布，其产量高，占全国白芷总产量70％以上，除供应国内市场外，还远销香港、东南亚、日本及欧美等地。白芷药材主要来源于栽培，生产上以种子繁殖为主，多采用自繁自育。通常种子成熟后在收获加工与储藏存放期间会发生活力下降的不可逆的变化，即种子劣变或老化。该过程表现为种子发芽率和生活力降低，内部相应酶系统发生改变，细胞膜的通透性增强等特点，进而影响种子质量，对生产造成严重损失。白芷种子在常规保存手段下，劣变速度较快，隔年陈种子发芽率不高，而制约种子发芽率的原因尚不清楚。种子劣变在种子贮藏过程中不可避免，直接影响种子的质量和种子的播种特性。种子劣变是一个涉及许多复杂生理生化反应的过程，包括脂质的过氧化、膜的变化与渗出物、酶活性、呼吸作用与atp含量、生物合成能力、内源激素及有毒物质含量等方面的变化，主要体现在种子发芽率、生活力、质膜完整性降低，内部保护酶系统活性减弱，有毒有害物质积累等特点。种子引发可看做是种子发芽的预准备，引发期间，种子内部进行复杂的生理生化变化和物质代谢，对劣变种子进行生化修补，包括各种酶和蛋白与膜的重新结合和恢复，提高膜的完整性，降低种子内有机物质的外渗，提高种子活力。种子引发技术是一项控制种子缓慢吸水和后期逐步回干的种子处理技术，使种子充分吸水到一定水平，保证种子有一定的预发芽代谢作用，又防止胚根伸长，是修复和提高种子活力的一种有效途径。目前，种子引发技术已用于许多植物中的研究，包括粮食、蔬菜、花卉、牧草等，尤其近20年来已作为一些蔬菜和花卉种子的播前常用处理技术，但在中药材种植方面的研究与应用较少。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种种子引发剂。本发明提供的种子引发剂包括氯化钠、硝酸钾和聚乙二醇。上述种子引发剂中，所述氯化钠、所述硝酸钾和所述聚乙二醇的质量比为3：3：175。上述种子引发剂中，所述种子引发剂由氯化钠、硝酸钾、聚乙二醇和水组成；所述氯化钠在所述种子引发剂中的质量分数为0.60％；所述硝酸钾在所述种子引发剂中的质量分数为0.60％；所述聚乙二醇在所述种子引发剂中的质量分数为35％。本发明的第二个目的是提供上述种子引发剂的新用途。本发明提供了上述种子引发剂在如下1)-10)中任一种中的应用：1)提高种子活力；2)制备提高种子活力的产品；3)提高种子发芽率和/或发芽势和/或发芽指数和/或活力指数；4)制备提高种子发芽率和/或发芽势和/或发芽指数和/或活力指数的产品；5)降低种子浸出液电导率；6)制备降低种子浸出液电导率的产品；7)提高种子过氧化物酶活性；8)制备提高种子过氧化物酶活性的产品；9)提高种子可溶性蛋白质含量；10)制备提高种子可溶性蛋白质含量的产品。上述应用中，所述种子为劣变种子；所述劣变种子具体为白芷劣变种子。本发明的第三个目的是提供一种提高种子活力的产品。本发明提供的提高种子活力的产品的活性成分为上述种子引发剂。本发明的第四个目的是提供一种提高种子活力的方法。本发明提供的提高种子活力的方法包括用上述种子引发剂对种子进行引发处理的步骤。上述方法中，所述种子引发剂与所述种子的配比为1g：5ml。本发明的第五个目的是提供上述产品或上述方法的新用途。本发明提供了上述产品或上述方法在如下(1)-(8)中任一种中的应用：(1)提高种子发芽率和/或发芽势和/或发芽指数和/或活力指数；(2)制备提高种子发芽率和/或发芽势和/或发芽指数和/或活力指数的产品；(3)降低种子浸出液电导率；(4)制备降低种子浸出液电导率的产品；(5)提高种子过氧化物酶活性；(6)制备提高种子过氧化物酶活性的产品；(7)提高种子可溶性蛋白质含量；(8)制备提高种子可溶性蛋白质含量的产品。上述产品或上述方法或上述应用中，所述种子为劣变种子；所述劣变种子具体为白芷劣变种子。在本发明的具体实施例中，所述白芷劣变种子来源于四川遂宁市永兴镇中脊村，2015年采收，种子含水量为9.92％，千粒重为2.64g，发芽率为53.7％，种子常温条件下贮藏约245天后用于试验。本发明采用常用的引发剂nacl、kno3和peg以不同配比对白芷种子进行引发处理，引发处理后进行种子发芽试验，通过测定不同处理种子的发芽指标和生理指标及种子发芽力和活力，分析不同引发处理对白芷劣变种子活力的影响，并比较不同引发剂配比间的引发效果，发掘最适宜的引发剂配比。实验结果表明，三因素复合引发对种子萌发影响的主次顺序是：peg>kno3>nacl，n2k1p3(0.60％nacl+0.60％kno3+35％peg)是最佳处理组合，引发处理后的白芷种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、可溶性蛋白、pod活性均得到不同程度提高，电导率降低。本发明的复合引发剂的使用不仅能改善和修复劣变种子已受损的膜系统，降低劣变种浸出液电导率、提高可溶性蛋白含量、增强pod酶活性，提高种子活力，而且为白芷种子的大田播种及药材生产提供依据。附图说明图1为复合引发剂处理对种子浸出液电导率的影响。图2为复合引发剂处理对种子可溶性蛋白含量的影响。图3为复合引发剂处理对种子pod活性的影响。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的供试白芷种子来源于四川遂宁市永兴镇中脊村，2015年采收，种子含水量为9.92％，千粒重为2.64g，发芽率为53.7％，种子常温条件下贮藏约245天后用于试验。下述实施例中所使用的化学引发剂聚乙二醇(peg6000)、nacl和kno3均为分析纯，均为鹏世达生物试剂有限公司的产品。下述实施例中的数据分析处理采用dps统计分析软件对数据进行方差分析，采用新复极差法进行显著性分析。实施例1、复合引发剂处理对白芷劣变种子活力的影响一、试验分组及试验方法1、试验分组试验选择nacl、kno3和peg作为复合引发剂，采用正交试验设计nacl、kno3和peg的配比，得到不同的复合引发剂处理组。正交试验的各因素及其水平见表1。根据正交试验设计，共进行9次试验。不同配比的复合引发剂处理组分别如下：处理组1：将nacl、kno3、peg和水混匀，得到复合引发剂1；复合引发剂1中的nacl、kno3和peg的质量分数分别为0.20％、0.60％和15％；处理组2：将nacl、kno3、peg和水混匀，得到复合引发剂2；复合引发剂2中的nacl、kno3和peg的质量分数分别为0.20％、1.80％和25％；处理组3：将nacl、kno3、peg和水混匀，得到复合引发剂3；复合引发剂3中的nacl、kno3和peg的质量分数分别为0.20％、3％和35％；处理组4：将nacl、kno3、peg和水混匀，得到复合引发剂4；复合引发剂4中的nacl、kno3和peg的质量分数分别为0.60％、1.80％和25％；处理组5：将nacl、kno3、peg和水混匀，得到复合引发剂5；复合引发剂5中的nacl、kno3和peg的质量分数分别为0.60％、3％和25％；处理组6：将nacl、kno3、peg和水混匀，得到复合引发剂6；复合引发剂6中的nacl、kno3和peg的质量分数分别为0.60％、0.60％和35％；处理组7：将nacl、kno3、peg和水混匀，得到复合引发剂7；复合引发剂7中的nacl、kno3和peg的质量分数分别为1％、3％和15％；处理组8：将nacl、kno3、peg和水混匀，得到复合引发剂8；复合引发剂8中的nacl、kno3和peg的质量分数分别为1％、0.60％和25％；处理组9：将nacl、kno3、peg和水混匀，得到复合引发剂9；复合引发剂9中的nacl、kno3和peg的质量分数分别为1％、1.80％和35％。表1、正交试验因素与水平l9(33)设计水平naclkno3peg10.20％0.60％15％20.60％1.80％25％31％3％35％表2正交试验表l9(33)2、种子引发处理选择大小和饱满度较为一致的白芷种子置于锥形瓶中，每个锥形瓶中放入10g种子，然后分别浸于50ml步骤1制备的不同的复合引发剂中进行种子引发处理，密封，20℃恒温培养箱处理24h，得到引发处理后种子，同时以蒸馏水为对照。引发结束后，取出种子，洗净，吸干种子表面水分后置于两层吸水纸间自然回干至原含水量后进行种子发芽试验。3、种子发芽试验及发芽情况统计将引发处理后种子进行种子发芽试验。具体步骤如下：将种子按10*10摆放种子发芽盒内湿润的发芽纸上。发芽温度设置为25℃/18℃昼夜变温，光照12h，每种处理随机选取100粒种子，3次重复。每日观察种子发芽情况，第15天统计发芽势，第40天统计发芽率，并计算发芽指数和活力指数。发芽指数(gi)＝σgt/dt(gt为在t天的发芽种子数，dt为相应种子发芽天数)；活力指数(ⅵ)＝σgi×s(s为苗鲜重)。4、电导率测定随机选取50粒步骤2得到的引发处理结束后回干至原含水量的种子，3次重复。用离子水冲洗3遍，再用滤纸吸干表面水分，然后将种子放入250ml烧杯中，加入100ml去离子水，测定初始电导率；用保鲜膜将烧杯封口，室温条件下静置24h后测定种子浸出液电导率。种子浸出液电导率[μs/(cm*g)]＝(种子浸出液电导率-初始电导率)/种子样品质量。5、过氧化物酶(pod)活性测定参照文献“张志良.植物生理学实验指导[m].北京：高等教育出版社，1990:123-124”中的方法测定步骤2得到的引发处理结束后回干至原含水量的种子的过氧化物酶活性，3次重复。具体步骤如下：取白芷种子0.5g，置于研钵中，加入5ml0.02mol/lkh2po4研磨成匀浆，4000r/min离心15min，收集上清液保存在冰上。所得残渣再用5ml0.02mol/lkh2po4提取一次，合并两次上清液，酶提取液10ml冰浴研磨，在4℃，1200r/min离心15min，上清液为酶粗提液，在0～4℃下保存。取酶提取液0.5ml(视酶活性大小稀释原液)，加3mlpod反应液，内含0.08％h2o2，0.1％愈创木酚的pbs(ph7.0)，立即于470nm处比色，每30s记录一次读数，记录读数3min，取呈线部分计算od值变化，酶活性单位以△od470/min·g表示。反应混合液配置100mmol/lph6.0磷酸缓冲液50ml，加入愈创木酚28ul，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19ul，混合均匀，保存于冰箱中，备用。6、可溶性蛋白质含量测定参照文献“高俊凤.植物生理学实验指导[m].北京：高等教育出版社，2006:142.”中的方法测定步骤2得到的引发处理结束后回干至原含水量的种子的可溶性蛋白质含量，3次重复。具体步骤如下：取白芷种子0.5g，置于研钵中用ph7.0磷酸缓冲液研磨成匀浆后，定容25ml，10000r/min离心10min，取上清液1ml(视蛋白质含量适当稀释)于试管中，备用。吸取样品提取液0.1ml，放入具塞刻度试管中(设两个重复管)，加入5ml考马斯亮蓝g-250试剂，充分混合，放置2min后在595nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线回归方程y＝0.0608x+0.2218(r2＝0.9073)查得蛋白质含量。蛋白质含量(％)＝c×v2×v0×100/(m×v1)，式中：c代表从标准曲线上查得的蛋白质浓度(g/ml)；v0代表样品溶液的总体积(ml)；v1代表测定时加样量(ml)；v2代表测定时定容体积(ml)；m代表样品的质量(g)。二、复合引发剂引发处理对种子的影响(一)复合引发剂引发处理对种子活力的影响复合引发剂处理对白芷劣变种子活力的影响如表3所示。从各处理组的发芽率数值可以看出，处理组6的种子发芽率最高，处理组7的发芽率最小，复合引发剂处理的最佳组合为处理组6中的复合引发剂6；从极差来看，三因素复合对发芽率影响的主次顺序是：peg>nacl>kno3；处理组3和处理组6与其他处理间差异显著，处理组4、处理组7和ck组间差异不显著。从各处理组的发芽势数值可以看出，处理组9的种子发芽势最高，ck组的发芽势最小，复合引发剂处理的最佳组合为处理组9中的复合引发剂9；从极差来看，三因素复合对发芽势影响的主次顺序是：peg>kno3>nacl；处理组6、处理组9与其他处理组间差异显著，处理组6与处理组9间差异不显著。从各处理组的发芽指数数值可以看出，处理组6的种子发芽指数最高，处理组7、ck组的发芽指数最小，复合引发剂处理的最佳组合为处理组6中的复合引发剂6；从极差来看，三因素复合对发芽指数影响的主次顺序是：peg>kno3>nacl；处理组3、处理组6、处理组9与其他处理间差异显著，处理组1、处理组4、处理组7、ck组间差异不显著。从各处理组的活力指数数值可以看出，处理组6的种子活力指数最高，处理组7的活力指数最小，复合引发剂处理的最佳组合为处理组6中的复合引发剂6；从极差来看，三因素复合对活力指数影响的主次顺序是：peg>kno3>nacl；处理组6与其他处理间差异显著，处理组1、处理组4、处理组7间差异不显著。由此可知，三因素复合引发对种子萌发影响的主次顺序是：peg>kno3>nacl；最佳复合引发剂为处理组6中的复合引发剂6(0.60％nacl+0.60％kno3+35％peg)。3因素中peg对白芷种子萌发及生理生化指标的影响最大，其次是nacl与kno3，且在复合引发剂中peg比例越高，引发效果越好，越低则效果越差，可能是因为peg为大分子化合物，主要是通过渗透调节控制种子的吸水量，不易渗入种子内部，对种子不造成伤害，nacl与kno3是属于无机盐类，其离子可以在处理过程中渗入种子内部并在种子中积累，从而降低种子渗透势，导致种子吸收更多水分反而降低引发效果，当三者达到一定平衡比例时，种子的吸水量正好处于吸胀吸水的第二阶段，即通过萌发初始阶段但胚根尚未突破种皮，期间种子进行贮藏物质和酶的活化，以及细胞膜、细胞器和dna的修复，提高种子活力，为萌芽做好生理准备。表3、复合引发剂引发处理对种子活力的影响正交设计方差分析注：m为均值，r为均值极差，表中同列小写和大写字母分别表示在0.05和0.01水平上的差异显著。(二)复合引发剂处理对白芷劣变种子内部生理生化的影响1、复合引发剂处理对白芷劣变种子电导率的影响细胞膜系统在细胞代谢活动中起着重要作用，不仅可以调节细胞物质的交流和运输，而且可以影响代谢过程中酶的活性。劣变后种子细胞膜的透性增加，细胞浸泡液浓度升高，电导率也随之增加。复合引发剂处理对白芷劣变种子电导率的影响见图1。从图中可以看出：处理组6的种子电导率最小，处理组7的电导率最大。处理组1、2、3、6、8与处理组5、7、9、ck间差异显著。由此可知，复合引发剂6是最佳的复合引发剂，可降低白芷劣变种子电导率。2、复合引发剂处理对白芷劣变种子可溶性蛋白含量的影响不同复合引发剂处理对白芷劣变种子可溶性蛋白含量的影响如图2所示。从图2可以看出：处理组6的种子可溶性蛋白含量最高，处理组7的种子可溶性蛋白含量最低。处理组3、6与其他处理间差异显著，处理组1、4、7、ck间差异不著。由此可知，复合引发剂6是最佳的复合引发剂，可提高白芷劣变种子可溶性蛋白含量。3、复合引发剂处理对白芷劣变种子pod活性的影响不同复合引发剂处理对白芷劣变种子pod活性的影响如图3所示。从图3可以看出：处理组6的种子pod活性最高，处理组7的种子pod活性最低。处理组3、6与处理组1、4、5、7、8、ck间差异显著，处理组1、4、7、ck间差异不显著。由此可知，复合引发剂6是最佳的复合引发剂，可提高白芷劣变种子pod活性。当前第1页12