一种杂交狼尾草的异源多倍体诱导生产方法与流程

本发明涉及植物育种和组培
技术领域：
，具体涉及一种杂交狼尾草的异源多倍体诱导生产方法。
背景技术：
：杂交狼尾草(pennisetumamericanum×p.purpureum)属禾本科狼尾草属多年生牧草，是四倍体象草(pennisetumpurpureumschum)和二倍体美洲狼尾草(pennisetumalopecuroides(l.)spreng)产生的种间异源三倍体杂种，生产上通常用无性繁殖或杂交一代种子繁殖。杂交狼尾草结合了双亲的优良性状具有明显的杂种优势，鲜草中粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、无氮浸出物和灰分的含量高，营养丰富，是一种优质高产适合饲喂牛、羊、鱼等多种草食动物的优质青饲料。另外，杂交狼尾草还可作为优质纸浆和人造板原料，还是重要的生物质能源作物。基于以上优点，研究人员又对其继续进行品种遗传改良工作，以期得到生物产量更高、适应能力强和能源利用品质优良的新品种。异源多倍体育种是植物创新育种的一种手段，通过染色体加倍技术，人工创造多倍体，是获得高生物质产量植物新品种的有效途径之一。然而，针对杂交狼尾草，目前尚无关于多倍体诱导育种方法的报道。技术实现要素：本发明人通过远缘杂交和染色体加倍相结合的方法，可以在最短的时间获得大量诱变试管苗，即异源六倍体杂交狼尾草。通过栽种实验验证，本发明获得的异源六倍体杂交狼尾草比异源三倍体杂交狼尾草具有更高的产量和品质，从而完成本发明。因此，本发明提供了一种杂交狼尾草的多倍体诱导生长方法，所述方法包括：(1)浸泡处理：将异源三倍体杂交狼尾草一代种子消毒后，在4℃下浸泡于诱变剂中，浸泡处理30-90min、优选60min，所述诱变剂是含有秋水仙碱和二甲基亚砜的已灭菌的混合液；(2)初代培养：将步骤(1)中浸泡处理后的种子取出，放置在无菌滤纸上晾干，然后直接接种到包含0.5-3.0mg/l秋水仙碱、优选1.5mg/l秋水仙碱的初代培养基上，在20-30℃、优选25℃，1000lx光照强度下，每天光照10h，光照培养25-35天、优选30天，获得植株；(3)多倍体鉴定：选择步骤(2)培养获得的植株中表型变异明显的植株，在生根培养基中培养生根，然后取根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定；染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体；(4)增殖培养：将步骤(3)中鉴定为多倍体的植株接种到增殖培养基上增殖培养6个月，获得瓶苗；(5)生产：将步骤(4)获得的瓶苗，接种到一次性成苗培养基中进行培养，在获得大量丛芽的同时，根部也形成大量健壮的根系，获得增殖生根苗；(6)移栽：将步骤(5)获得的增殖生根苗，置于自然光下炼苗3-5天；然后取出，清洗根系上的培养基，选择阴天或傍晚时分直接移栽至大田。优选地，步骤(1)中，所述诱变剂中包含1.0-3.0mg/l的秋水仙碱和1.5-2.0mg/l的二甲基亚砜，更优选包含1.5mg/l的秋水仙碱和1.5mg/l的二甲基亚砜；优选地，步骤(1)中，所述种子消毒的具体步骤为：首先将所述种子放在无菌操作台上用无菌水洗5-7次，再用70％酒精浸润30秒-1分钟，然后放入0.1％的二氯化汞溶液中灭菌12-18分钟，再用无菌水冲洗5-6次。优选地，步骤(2)中，所述初代培养基为包含n6+6-ba3.0-5.0mg/l+矮壮素3.0-5.0mg/l的琼脂固体培养基，优选包含n6+6-ba5.0mg/l+矮壮素5.0mg/l或n6+6-ba4.0mg/l+矮壮素5.0mg/l的琼脂固体培养基。优选地，步骤(3)中，所述生根培养基为包含1/2ms+多效唑0.5-3.0mg/l的琼脂固体培养基；优选包含1/2ms+多效唑1.0mg/l或1/2ms+多效唑1.5mg/l的琼脂固体培养基。优选地，步骤(4)中，所述增殖培养基为包含1/2ms+6-ba1.0-2.5mg/l+多效唑3.0-5.0mg/l的琼脂固体培养基，优选包含1/2ms+6-ba1.0mg/l+多效唑5.0mg/l或1/2ms+6-ba2.0mg/l+多效唑5.0mg/l的琼脂固体培养基。优选地，步骤(5)中，所述一次性成苗培养基为包含1/2ms+6-ba1.0-2.5mg/l+多效唑3.0-5.0mg/l的琼脂固体培养基。本发明的技术方案具有如下的优点和效果：1、本发明选择异源三倍体杂交狼尾草一代种子作为外植体，消毒后直接用诱变剂处理，操作简便，取材容易；2、本发明采用诱变剂溶液浸泡法与加入培养基培养法相结合的处理方式，只需培养20天左右，就能获得大量变异植株；大大提高了诱变效率，节省了诱变探索时间；3、本发明仅选择表型变异明显(如图2所示)的植株进行染色体核型鉴定；将鉴定为异源六倍体的植株转入增殖培养基中培养30天左右，获得大量丛生芽，增殖倍数达到7以上；每瓶获得有效苗30株以上，大大提高了培养效率，节约了生产成本；4、批量化生产阶段同步诱导芽和根，将增殖与生根简化为一步完成，即“一步成苗”方法，形成完整植株只需20天左右，短时间内能将异源六倍体杂交狼尾草应用到生产中；5、本发明选择异源三倍体杂交狼尾草植株为对照(如图5-图9所示)；两者移栽条件一致，异源六倍体植株相比于对照植株高且茎色浓绿，茎粗、节间短且腋芽多、叶短而宽、分蘖数多，气生根多，尤其是营养成分明显提高。因此，本发明提供了一套高效低耗量的培养体系，能够以最快的速度将研究成果转化为现实生产力。附图说明图1示出了异源三倍体杂交狼尾草植株的生长情况；图2示出了异源六倍体杂交狼尾草植株的生长情况；图3示出了异源三倍体杂交狼尾草(3×)染色体核型图(1000×)；图4示出了异源六倍体杂交狼尾草(6×)染色体核型图(1000×)；图5示出了异源三倍体杂交狼尾草大田苗的生长情况。图6示出了异源六倍体杂交狼尾草大田苗的生长情况。图7是异源三倍体杂交狼尾草大田苗叶片(左)和异源六倍体杂交狼尾草大田苗叶片(右)的照片。图8是异源三倍体杂交狼尾草大田苗杆(左)和异源六倍体杂交狼尾草大田苗杆(右)的照片。图9是异源三倍体杂交狼尾草大田苗穗(左)和异源六倍体杂交狼尾草大田苗穗(右)的照片。具体实施方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非对本发明的技术方案进行限制。实施例1采用以下方法对杂交狼尾草进行多倍体诱导生产：一、培养基配制和灭菌初代培养基：①n6+6-ba3.0mg/l+矮壮素3.0mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂；②n6+6-ba4.0mg/l+矮壮素5.0mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂；③n6+6-ba5.0mg/l+矮壮素5.0mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂。增殖培养基：①1/2ms+6-ba1.0mg/l+多效唑5.0mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂；②1/2ms+6-ba2.0mg/l+多效唑5.0mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂；③1/2ms+6-ba2.5mg/l+多效唑3.0mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂。以上培养基121℃下，灭菌20分钟。生根培养基：①1/2ms+多效唑0.5mg/l+2％蔗糖+0.75％琼脂；②1/2ms+多效唑1.0mg/l+2％蔗糖+0.75％琼脂；③1/2ms+多效唑1.5mg/l+2％蔗糖+0.75％琼脂；④1/2ms+多效唑2.0mg/l+2％蔗糖+0.75％琼脂；⑤1/2ms+多效唑3.0mg/l+2％蔗糖+0.75％琼脂。一次性成苗培养基：①1/2ms+6-ba1.0mg/l+多效唑3.0mg/l；②1/2ms+6-ba2.0mg/l+多效唑5.0mg/l；③1/2ms+6-ba2.5mg/l+多效唑5.0mg/l。二、浸泡处理取杂交狼尾草(juncuseffususl.)异源三倍体杂交一代种子，在无菌操作台上用无菌水洗6次，用70％酒精浸润1分钟，再放入0.1％的二氯化汞溶液中灭菌15分钟，无菌水冲洗6次后，浸泡于含有已过滤灭菌的秋水仙碱1.5mg/l和1.5mg/l二甲基亚砜的诱变剂中浸泡60min，处理温度为4℃左右，然后取出清洗干净后备用。三、初代培养将浸泡处理后的种子用滤纸吸干水分，分别接入装有包含1.5mg/l秋水仙碱的初代培养基①、②和③的塑料培养瓶(容量60毫升)中，每个培养瓶外植体个数为10个，接种30瓶，重复三次。在下述培养条件下进行培养：25℃左右，每天光照10小时，光照强度为1000-2000lx左右；种子培养7天左右开始萌芽，但萌发的芽较弱，迅速长高，表型变异不明显；培养30天左右萌发的芽表型变异明显，芽粗且基部膨大；但培养35天以上萌发的芽易褐化，逐渐死亡。四、多倍体鉴定选择表型变异明显(如图2所述，杆茎较粗、叶片较多且大、颜色更深)的植株，将其分别接种到生根培养基①、②、③、④和⑤上进行培养，切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定，染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。五、增殖培养将鉴定为多倍体的植株，分别接种到增殖培养基①、②和③上增殖培养6个月，使其增殖新芽，增殖倍数达到7以上，获得瓶苗；六、生产将瓶苗接种到1/2ms+6-ba2.0mg/l+多效唑5.0mg/l的一次性成苗培养基中培养，在获得大量丛芽的同时，根部也形成大量健壮的根系，获得增殖生根苗；结果显示，芽增殖倍数为5以上，芽苗健壮，每瓶有效苗30株以上，同步生根率达100％,；七、移栽将增殖生根苗置自然光下打开瓶盖，炼苗3-5天；然后用镊子取出清洗根系上的培养基，选择阴天或傍晚时分直接移栽至大田。移栽1个月左右，成活达到90％以上。对各步骤中的植株、瓶苗、增殖生根苗的生长情况进行观察，发现初代培养基②和③要优于初代培养基①；生根培养基②和③优于生根培养基①、④、⑤；增殖培养基①和②优于增殖培养基③；一次性成苗培养基②和③优于一次性成苗培养基①。实验实施例1在本实验实施例中，采用诱变剂溶液浸泡法、加入培养基法、溶液浸泡和加入培养基组合法三种方法进行多倍体诱导试验，每种方法均设置了若干组处理时间和浓度梯度，研究了不同温度、不同处理方法、不同浓度诱变剂及不同处理时间对多倍体诱导率的影响。a、诱变剂溶液浸泡法：取杂交狼尾草(juncuseffususl.)异源三倍体杂交一代种子，在无菌操作台上消毒后，浸泡于分别含有已过滤灭菌的秋水仙碱(1.0mg/l、2.0mg/l、3.0mg/l)和二甲基亚砜(1.5mg/l、2.0mg/l)的诱变剂中浸泡30min、60min、90min，处理温度为4℃，然后取出清洗干净，接种在初代培养基②上，每个处理接种外植体个数为10个，30瓶，各重复三次。b、加入培养基法：取杂交狼尾草(juncuseffususl.)异源三倍体杂交一代种子，在无菌操作台上消毒后，用滤纸吸干水分，分别接入装有包含0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.0mg/l、2.5mg/l、3.0mg/l的秋水仙碱的初代培养基②的塑料培养瓶(容量60毫升)中，每个培养瓶外植体个数为10个，接种30瓶，重复三次。c、溶液浸泡和加入培养基混合法：取杂交狼尾草(juncuseffususl.)异源三倍体杂交一代种子，在无菌操作台上消毒后，在4℃下分别浸泡于含有已过滤灭菌的秋水仙碱(1.0mg/l、2.0mg/l、3.0mg/l)和二甲基亚砜(1.5mg/l、2.0mg/l)的诱变剂中浸泡30min、60min、90min，然后取出清洗干净，用滤纸吸干水分，分别接入装有包含0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.0mg/l、2.5mg/l、3.0mg/l秋水仙碱的初代培养基②的塑料培养瓶(容量60毫升)中，每个培养瓶外植体个数为10个，接种30瓶，重复三次。结果与分析(1)本实验实施例中采用诱变剂溶液浸泡法、加入培养基法、溶液浸泡和加入培养基组合法这三种处理方法均能获得一定比率的诱变苗，但是长时间溶液浸泡处理致死率高达90％以上，加入培养基法致死率低、但诱变率也低。本发明的溶液浸泡和加入培养基组合法诱导率最高，最佳组合参数为：在含有1.5mg/l秋水仙素和1.5mg/l二甲基亚砜的诱变剂中，在4℃冰箱中浸泡处理60min，然后将其接种到包含1.5mg/l秋水仙碱初代培养基②上培养。该组合在诱变剂的作用下毒害无菌苗的致死率为27.07％，因此，溶液浸泡和加入培养基组合法效果明显优于溶液浸泡法，或加入培养基法；异源三倍体杂交狼尾草与异源六倍体杂交狼尾草植株的生长情况分别如图1、图2所示。(2)染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。本发明通过大量鉴定数据表明，该狼尾草异源三倍体染色体数目为3n＝3x＝21；六倍体为6n＝6x＝42；本发明最优组合异源六倍体诱导率达到66.67％，嵌合体诱导率达到26.67％。异源三倍体杂交狼尾草与异源六倍体杂交狼尾草植株染色体核型图分别如图3、图4所示。(3)本发明选择异源三倍体杂交狼尾草植株为对照；两者移栽条件一致，种苗为异源六倍体杂交狼尾草的植株相比于对照植株高且茎色浓绿，茎粗、节间短且腋芽多、叶短而宽、分蘖数多，须根粗壮，花序变大，尤其是营养成分明显提高。异源三倍体杂交狼尾草与异源六倍体杂交狼尾草的主要形态特征比较如表1所示，两者的主要营养成分比较如表2所示，异源三倍体杂交狼尾草与异源六倍体杂交狼尾草植株的长势如图5-9所示。表1异源三倍体杂交狼尾草与异源六倍体杂交狼尾草的主要形态特征比较表2异源三倍体杂交狼尾草与异源六倍体杂交狼尾草的主要营养成分的比较序号类型干物质含量粗蛋白含量粗脂肪含量粗纤维含量1异源三倍体15.82±0.0613.39±0.214.69±0.1733.49±0.082异源六倍体16.74±0.0715.91±0.856.37±0.1233.58±0.46以上仅描述了本发明专利的较佳实施方式，但本发明专利并不限于上述实施例。本领域技术人员可以理解的是，能够实现本发明专利技术效果的任何相同或相似手段，均应落入本发明专利的保护范围内。当前第1页12