一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法与流程

本发明涉及细胞程序性坏死研究
技术领域：
，特别涉及一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法。
背景技术：
：细胞程序性坏死是一种由死亡受体介导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)非依赖性细胞死亡模式，通常在凋亡被抑制的情况下发生，死亡细胞具有明显的坏死特征。研究表明，细胞程序性坏死在缺血再灌注和炎症反应等多种因素导致的组织(如肝脏)损伤或坏死中发挥重要作用，有效抑制细胞程序性坏死对这些因素诱导的组织损伤或坏死具有重要的预防和治疗作用。目前常用于诱导细胞程序性坏死的诱导剂包括融合蛋白、病毒转染系统和黍子籽粒蛋白，但是其中涉及复杂的诱导剂制备过程，包括构建载体、转染、诱导等许多步骤，以及涉及脱盐、阳离子交换层析和凝胶层析等繁琐步骤获得纯化蛋白的制备过程，因此，利用此类诱导剂构建细胞程序性坏死模型存在步骤繁琐的缺点。技术实现要素：本发明的主要目的是提出一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法，旨在成功建立肝脏细胞程序性坏死模型，且建立方法简单、效果稳定可靠。为实现上述目的，本发明提出一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法，包括如下步骤：对试验仔猪进行脂多糖诱导处理，得到待测仔猪；从待测仔猪的前腔静脉采血并分离血清，测定血清中的生化指标，判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响；取待测仔猪的肝脏样品，观察肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构，并测定肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达，分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用。优选地，对试验仔猪进行脂多糖诱导处理，得到待测仔猪的步骤中：所述脂多糖为大肠杆菌血清型脂多糖，纯度大于99％，诱导处理的方式为腹膜注射。优选地，所述大肠杆菌血清型脂多糖的注射量为仔猪每公斤体重注射80～150μg，诱导时长为2～24h。优选地，对试验仔猪进行脂多糖诱导处理，得到待测仔猪的步骤之前，还包括：将试验仔猪饲养在饲养笼中，试验仔猪于22～25℃温度条件下自由采食饮水10天；其中，在对仔猪进行诱导处理前10～13h停止供料。优选地，所述试验仔猪为34～36日龄的断奶仔猪，体重为8.7～9.1kg。优选地，从待测仔猪的前腔静脉采血并分离血清，测定血清中的生化指标，判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响的步骤，具体包括：用促凝真空管从待测仔猪的前腔静脉采血，然后通过离心分离得到血清，利用生化分析仪测定血清中的生化指标，判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响；其中，生化指标包括血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶以及谷氨酰转肽酶的活性。优选地，取待测仔猪的肝脏样品，观察肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构，并测定肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达，分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用的步骤，具体包括：对采血后的待测仔猪进行戊巴比妥钠肌肉注射，使待测仔猪完全麻醉后屠宰并取出肝脏；将肝脏放置于冰上，并用生理盐水冲掉肝脏上的血迹，然后切取肝脏样品，用于肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构观察，取部分剩余肝脏剪碎后，用于肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达的测定，根据观测结果分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用；其中，所述肝脏细胞程序性坏死关键基因包括受体相互作用蛋白1、受体相互作用蛋白3、混合系列蛋白激酶结构域样蛋白以及磷酸甘油酸变位酶5。本发明提供的技术方案中，以脂多糖为诱导剂，以肝脏细胞作为细胞程序性坏死模型的模型细胞，并以仔猪作为建模对象，成功建立了肝脏细胞程序性坏死模型，操作方法简便易行；通过测定肝脏细胞程序性坏死的关键基因及蛋白表达，具有测定结果可靠且重复性好的优点。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实施例2中对照组的肝脏组织的形态结构观察结果图；图2为本发明实施例2中处理组的肝脏组织的形态结构观察结果图；图3为本发明实施例3中对照组的肝细胞放大1700倍的超微结构观察结果图；图4为本发明实施例3中处理组的肝细胞放大1700倍的超微结构观察结果图；图5为本发明实施例3中处理组的肝细胞放大5000倍的超微结构观察结果图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明提出一种脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法，所述脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法包括如下步骤：步骤s10、对试验仔猪进行脂多糖诱导处理，得到待测仔猪；由于猪和人在体重、解剖及生理结构特征方面与人体极为相似，因此，以活体仔猪作为建模对象，使得通过本发明提供的方法建立的肝脏细胞程序性坏死模型，更便于研究人体肝脏细胞的程序性坏死，进而研究肝脏损伤机制，从而为人类肝脏疾病的预防及相关药物的研究起到重要作用。脂多糖(lps)又称为内毒素，是革兰氏阴性菌细胞外膜的结构成分，于细菌菌体死亡破裂或人工方法裂解后释放或活跃繁殖时释放出来。lps本身无毒性作用，但它进入微循环后，能刺激多种细胞合成释放炎性因子，如tnf-α(肿瘤坏死因子-α)、il-1(白细胞介素1)和il-6(白细胞介素6)等，引起全身炎症反应综合症、脓毒血症和感染性休克等疾病；lps也会导致组织器官的损伤，如刺激肝脏枯否细胞分泌大量tnf-α，造成肝脏结构和功能损伤。在本发明技术方案中，以lps为诱导剂来建立肝脏细胞程序性坏死模型，具有诱导剂来源简便(可直接购买)、成本低廉、建模时间短的特点。在具体实施时，步骤s10中：所述脂多糖为大肠杆菌血清型脂多糖，纯度大于99％，诱导处理的方式为腹膜注射。在本发明实施例中，对试验仔猪进行诱导处理的方法为腹膜注射，向试验仔猪注射一定量的脂多糖诱导剂(一定浓度)后，间隔一段时间后，获得待测仔猪，并对脂多糖诱导结果进行相关检测。在本发明技术方案中，所述诱导剂为大肠杆菌血清型脂多糖(大肠杆菌血清型o55：b5)，纯度大于99％。其中，所述大肠杆菌血清型脂多糖的注射量为仔猪每公斤体重注射80～150μg，诱导时长为2～24h。所述脂多糖的注射量越大，对试验仔猪刺激诱导所需要的时间就越短，在本发明的一实施例中，具体操作可采用如下方法：向试验仔猪每千克腹膜注射100μg的lps(大肠杆菌血清型o55：b5，纯度大于99％)，诱导4h后，即可导致试验仔猪的肝脏细胞发生程序性坏死，从而成功建立仔猪肝脏细胞程序性坏死模型，具有模型构建时间短的优点。可选地，在步骤s10之前还包括：将试验仔猪饲养在饲养笼中，试验仔猪于22～25℃温度条件下自由采食饮水10天；其中，在对仔猪进行诱导处理前10～13h停止供料。其中，所述试验仔猪为34～36日龄的断奶仔猪，体重为8.7～9.1kg。具体实施过程为：选择体重为8.7～9.1kg、34～36日龄的杜洛克×长白×大白断奶仔猪，饲养在1.8×1.1m2的不锈钢饲养笼中，饲养期间饲养温度为22～25℃，并自由采食和饮水，饲养10天后，对试验仔猪进行诱导处理，并且在诱导处理前12h停止供料。步骤s20、从待测仔猪的前腔静脉采血并分离血清，测定血清中的生化指标，判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响；在具体实施时，步骤s20具体包括：用促凝真空管从待测仔猪的前腔静脉采血，然后通过离心分离得到血清，利用生化分析仪测定血清中的生化指标，判断脂多糖诱导对仔猪肝脏功能的影响；其中，生化指标包括血清中谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、碱性磷酸酶(akp)以及谷氨酰转肽酶(ggt)的活性。具体操作方法可以为：从注射脂多糖诱导剂4h后的试验仔猪的前腔静脉采血，然后于3500r/min条件下离心10min，分离出血清，置于-80℃条件下冻存，利用生化分析仪测定血清中的相关酶的活性，从而判断lps对肝脏功能的影响。步骤s30、取待测仔猪的肝脏样品，观察肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构，并测定肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达，分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用。在采血后，取待测仔猪的肝脏样品，分别利用高清晰度彩色病理图文报告分析系统、tecnaig220twin透射电子显微镜观察lps刺激对肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构的影响；然后测定肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达，判断lps刺激对肝脏细胞程序性坏死的影响。可选地，步骤s30具体包括：步骤s31、对采血后的待测仔猪进行戊巴比妥钠肌肉注射，使待测仔猪完全麻醉后屠宰并取出肝脏；待测仔猪采血后，通过肌肉注射80mg/kg体重的戊巴比妥钠，使待测仔猪完全麻醉后进行屠宰并解剖取出肝脏。步骤s32、将肝脏放置于冰上，并用生理盐水冲掉肝脏上的血迹，然后切取肝脏样品，用于肝脏组织的形态结构和肝细胞的超微结构观察，取部分剩余肝脏剪碎后，用于肝脏细胞程序性坏死关键基因及其蛋白表达的测定，根据观测结果分析脂多糖诱导对仔猪肝脏细胞程序性坏死的作用；其中，所述肝脏细胞程序性坏死关键基因包括受体相互作用蛋白1(rip1)、受体相互作用蛋白3(rip3)、混合系列蛋白激酶结构域样蛋白(mlkl)以及磷酸甘油酸变位酶5(pgam5)。将解剖取出的肝脏立即置于冰上，用4℃的生理盐水冲掉血迹，切取0.5cm3的小块肝脏样品，用4％的多聚甲醛固定后用于肝脏组织的形态结构观察，同时取2mm3肝脏样品，固定于2.5％的戊二醛4h以上，用于肝细胞的超微结构观察；剩余肝脏样品用滤纸吸干水分，然后取部分剪碎，并立即放入液氮中速冻后，转入-80℃条件下的低温冰箱中保存，待测如下指标：(1)肝脏紧密连接蛋白claudin-1、热休克蛋白70(hsp70)的蛋白表达；(2)肝脏细胞程序性坏死关键基因rip1、rip3、mlkl和pgam5的mrna表达，以及rip1、rip3和mlkl的蛋白表达；(3)肝脏炎性因子，包括肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)、环氧合酶2(cox2)和hsp70的mrna表达。本发明提供的技术方案中，以脂多糖为诱导剂，以肝脏细胞作为细胞程序性坏死模型的模型细胞，并以仔猪作为建模对象，成功建立了肝脏细胞程序性坏死模型，操作方法简便易行；通过测定肝脏细胞程序性坏死的关键基因及蛋白表达，具有测定结果可靠且重复性好的优点。以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1试验设计与组织样品采集(1)选择12头杜洛克×长白×大白断奶仔猪(8.9±0.2kg，35±1d)，按体重相近原则，随机分配到2个处理组(对照组和处理组)中，每个处理组6个重复。将试验仔猪饲养在1.80×1.10m2不锈钢饲养笼中，饲养期间饲养温度为22-25℃，并自由采食和饮水。饲养10d后，处理组按仔猪每kg体重腹膜注射100μg的脂多糖(lps，大肠杆菌血清型o55：b5，纯度>99％，sigma公司)，对照组注射等量的0.9％的生理盐水(注射前12h停止供料)。(2)试验仔猪腹膜注射lps(处理组)或生理盐水(对照组)4h后，用促凝真空管(北京隆巨恒达科技有限公司)从试验仔猪前腔静脉采血10ml，随后于3500r/min离心10min分离血清，将血清于-80℃冻存待测。(3)采血后所有试验仔猪经肌肉注射80mg/kg体重的戊巴比妥钠，完全麻醉后屠宰。试验仔猪屠宰后解剖取肝脏并立即放于冰上，用4℃的生理盐水冲掉血迹，切取0.5cm3小块用4％的多聚甲醛固定，用于肝脏组织形态结构观察；再切取2mm3小块固定于2.5％的戊二醛4h以上，用于肝细胞的超微结构观察；剩余部分用滤纸吸干水分，然后取部分剪碎，用锡箔纸包起来，立即放入液氮中速冻，然后转入-80℃低温冰箱中保存待测。实施例2lps刺激对仔猪肝脏组织的形态结构的影响将屠宰后解剖取出的新鲜肝脏组织固定于4％的多聚甲醛24h以上，利用高清晰度彩色病理图文报告分析系统观察lps刺激对肝脏组织的形态结构的影响，具体方法如下：(1)将肝脏组织从固定液中取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内，将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水：75％酒精(4h)、85％酒精(2h)、90％酒精(2h)、95％酒精(1h)、无水乙醇ⅰ(30min)、无水乙醇ⅱ(30min)、醇苯(5～10min)、二甲苯ⅰ(5～10min)、二甲苯ⅱ(5～10min)、蜡ⅰ(1h)、蜡ⅱ(1h)、蜡ⅲ(1h)。(2)将浸好蜡的肝脏组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将肝脏组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冰箱冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。(3)将切片漂浮于摊片机，于40℃温水上将肝脏组织展开，用载玻片将肝脏组织捞起，并放进60℃烘箱(dgx-9003b，上海福玛实验仪器有限公司)内烤片。依次将切片放入二甲苯ⅰ(20min)、二甲苯ⅱ(20min)、无水乙醇ⅰ(10min)、95％酒精(5min)、90％酒精(5min)、80％酒精(5min)、70％酒精以及蒸馏水洗。(4)然后将切片依次进行harris苏木素(博士德生物工程有限公司)染色3-8min、自来水洗、1％的盐酸酒精分化数秒、自来水冲洗、0.6％氨水返蓝、流水冲洗；最后将切片在伊红染液中染色1-3min后封片。采用hpias-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统(同济千屏影像公司)观察肝脏组织的形态结构。对照组和处理组的肝脏组织的形态结构观察结果图分别如图1和图2所示。由图1和图2可知，对照组的肝脏形态完整，表现为肝细胞呈放射状排列，肝细胞索清晰可见；处理组的肝脏形态损伤严重，表现为肝细胞索排列紊乱，大面积细胞核溶解(a)、固缩(b)以及大量的炎性细胞浸润(c)。说明对试验仔猪进行lps刺激4h后，导致试验仔猪肝脏形态发生严重损伤。实施例3lps刺激对仔猪肝细胞的超微结构的影响将屠宰后解剖取出的新鲜肝脏组织固定于2.5％戊二醛4h以上，利用tecnaig220twin透射电子显微镜观察lps刺激对肝细胞超微结构的影响，具体方法如下：(1)切取2mm3的肝脏样品，加入浓度为2.5％的戊二醛，于4℃保存固定4h后，用0.1m的磷酸缓冲液(ph值为7.4)漂洗3次，每次15min；然后用4℃预冷的1％锇酸，于20℃固定2～3h；再用0.1m的磷酸缓冲液(ph值为7.4)漂洗3次，每次15min。(2)将经步骤(1)处理的肝脏样品经梯度酒精(30％、50％、70％、80％、85％、90％、95％、100％两次)脱水，每次15～20min。然后将脱水后的肝脏组织于37℃恒温箱中进行渗透处理，渗透剂依次为丙酮：环氧树脂(2：1)、丙酮：环氧树脂(1：1)、环氧树脂，每次渗透8～12h。(3)将经渗透处理过的肝脏样品放入胶囊或包埋板中，加入包埋剂环氧树脂，在60℃恒温箱聚合48h；然后进行超薄切片，切片厚度为80～100nm；最后对切片进行铅和铀双染色，即使用2％的醋酸铀饱和水溶液和枸橼酸铅，于室温下染色15min，然后置于室温下干燥过夜后，用于电镜观察。对照组和处理组的肝细胞的超微结构的观察结果分别如图3至图5所示，其中，图3为对照组的肝细胞放大1700倍的超微结构观察结果图，图4和图5分别为处理组的肝细胞放大1700倍和5000倍的超微结构观察结果图。由图3(1700倍)可知，对照组肝细胞核呈椭圆形，核膜完整，细胞浆线粒体(a)较少，内质网(b)、线粒体形态完整。而图4(1700倍)中，处理组肝细胞核(d)变形；图5(5000倍)中，处理组肝细胞的线粒体(a)增多，部分线粒体肿胀，内质网(b)扩张，肝细胞胞浆出现自噬小体(c)。说明对试验仔猪进行lps刺激4h后，导致肝细胞发生典型的程序性坏死现象。实施例4lps刺激对仔猪血清alt、ast、akp和ggt活性的影响采用hitachi7100全自动生化分析仪(南京舒普思达医疗设备有限公司，日立7100型)，测定血清中alt(谷丙转氨酶)、ast(谷草转氨酶)、akp(碱性磷酸酶)和ggt(谷氨酰转肽酶)的活性。其中akp和ggt是通过速率法测定，alt和ast是通过紫外连续监测法测定，试剂盒购自德赛诊断系统(上海)有限公司。测定结果如表1所示(所有实施例的表格中，p＜0.05，表示对照组和处理组差异显著)。表1lps对血液生化指标的影响对照组处理组p值alt(u/l)75.7±6.165.0±19.10.307ast(u/l)85.0±2.3159.3±69.30.047alt/ast0.895±0.1800.508±0.3140.026akp(u/l)280±17422±930.013ggt(u/l)39.6±8.1655.4±11.90.023其中，ast和alt是反映肝功能的重要指标，正常状态下，它们存在肝细胞内；当肝细胞受损时，ast和alt会从肝细胞进入血液，导致血液中ast和alt活性升高。另外，ast存在肝细胞中的线粒体内，当肝细胞轻度受损时，线粒体保持完整，而当肝细胞严重受损时，肝细胞的线粒体被破坏，ast从线粒体进入到血液，因此alt/ast比值下降则说明肝脏严重受损。与alt和ast相似，血液akp和ggt的活性也是反应肝脏功能的两个辅助指标。结合上述机理及表1中的测定结果可知，与对照组相比，lps刺激显著提高了仔猪血清ast、akp、ggt活性(p＜0.05)，降低了血清alt/ast比值(p＜0.05)。因此，本试验结果说明，对试验仔猪进行lps刺激4h后，导致肝脏功能严重受损。实施例5lps刺激对仔猪肝脏claudin-1、hsp70蛋白表达的影响采取westernblot分析方法测定仔猪肝脏claudin-1(紧密连接蛋白)、hsp70(热休克蛋白70)蛋白表达，具体方法如下：(1)将肝脏样品在液氮环境中研碎，取约0.15g肝脏溶解于600μl的蛋白裂解液中，冰浴匀浆后，在4℃、12000r/min条件下离心15min，取上清转移至新的预冷的离心管中，获得全蛋白提取物，即为蛋白样品。其中，1ml裂解液中加5μl磷酸酶抑制剂、2μl蛋白酶抑制剂和5μl浓度为100mm的苯甲基磺酰氟蛋白酶抑制剂(pmsf)，以上试剂均来源于凯基全蛋白提取试剂盒kgp2100(购自南京凯基生物发展有限公司)。(2)用1mg/ml牛血清白蛋白液(bsa，江苏碧云天生物技术公司)对蛋白样品进行定量，用蒸馏水将蛋白样品调成相同浓度，加入等体积上样缓冲液，于100℃金属浴煮8min使蛋白变性，样品用于电泳分离。(3)根据不同蛋白的分子量配制相应浓度的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，分别取10μl蛋白样品上样，电泳后转至pvdf膜(聚偏氟乙烯膜，杭州联科生物技术股份有限公司)上，5％脱脂奶粉(cellsignalingtechnology公司)室温封闭1h。(4)tris-hcl缓冲液(1‰tween-20)洗5min×3次后孵一抗，4℃过夜。一抗分别为兔源claudin-1抗体(invitrogen公司，1：1000稀释)、鼠源热休克蛋白(hsp)70抗体(enzolifesciences公司，1：1000稀释)，claudin-1和hsp70内参均为鼠源β-actin抗体(a2228，sigma公司，1：1000稀释)。(5)洗膜后二抗室温下孵育2h，claudin-1二抗为羊抗兔igg-hgp，hsp70和β-actin抗体二抗为羊抗鼠igg-hrp(所有二抗均购自武汉安特捷生物技术有限公司，以1：5000稀释)。(6)tris-hcl缓冲液(1‰tween-20)洗膜10min×3次后用ecl试剂(pierce公司)荧光显色，于alphainnotech成像系统中检测及分析条带强度。claudin-1和hsp70蛋白水平分别以claudin-1和hsp70的条带强度与β-actin的条带强度比值表示，结果如表2所示。表2lps对claudin-1和hsp70蛋白表达的影响claudin-1是一种紧密连接蛋白，紧密连接具有维护肝脏屏障功能和结构完整性的作用。而hsp70是典型的抗炎因子，当炎性介质含量增加时，hsp70的含量也会相应的增加，以抑制炎性介质的过量产生，降低炎症反应。结合上述机理及表2中的测定结果可知，与对照组相比，lps刺激显著降低了肝脏claudin-1蛋白表达，且同时提高了肝脏hsp70蛋白表达(p＜0.05)，说明对试验仔猪进行lps刺激4h后，导致了肝脏屏障功能的损伤和炎症反应。实施例6lps刺激对仔猪肝脏细胞程序性坏死关键因子rip1、rip3、mlkl和pgam5mrna表达的影响肝脏组织总rna提取用rnaisoplus(takara，宝生物工程(大连)有限公司)提取，rip1(受体相互作用蛋白1)、rip3(受体相互作用蛋白3)、mlkl(混合系列蛋白激酶结构域样蛋白)和pgam5(磷酸甘油酸变位酶5)mrna的表达水平均采用realtimepcr分析，具体方法如下：(1)将肝脏样品在液氮环境中研碎，取小于0.1g肝脏溶解于装有1mlrnaisoplus试剂的离心管中，放置冰上，将离心管置于冰浴中进行匀浆，至无颗粒透明状，室温静置5min后，用冷冻离心机(sigma公司)于12000g、4℃条件下离心5min；小心吸取上清液900μl移入新的1.5ml离心管中，向上清液中加入200μl氯仿，盖紧管盖，用手剧烈震荡15s，待溶液充分乳化后(无分相现象)，室温静置5min，于12000g、4℃条件下离心15min；从离心机小心取出离心管，溶液分3层，吸取上清液400～500μl至另一新的1.5ml离心管，向上清液加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管，充分混匀后，15～30℃静置10min，于12000g、4℃离心10min；小心去除上清，缓慢沿管壁加入1ml75％乙醇(勿吹起触及沉淀)，轻轻上下颠倒离心管洗涤，于12000g、4℃离心5min，小心弃去乙醇；室温干燥沉淀5min，加入40μlrnasefreedh2o溶解沉淀，用移液器轻吹沉淀，使rna完全溶解；rna浓度通过超微量分光光度计(nanodrop2000，thermoscientific公司)检测，纯度以吸光值260/280表示，范围在1.8～2.2，rna的完整性通过tanon-4100凝胶成像系统(上海天能)来检测，rna样品放入-80℃保存。(2)cdna合成按照rtreagentkitwithgdnaeraser(cdna合成试剂盒)(takara，宝生物工程(大连)有限公司)规定的步骤完成：a、基因组dna的除去：在200μl的离心管中，依次加入1μgrna、2μl5×gdnaeraserbuffer和1μlgdnaeraser，并加入rnasefreedh2o至10μl。在42℃反应2min。b、反转录反应：4μlbuffer，1μlrtenzymemix，1.0μlrtprimermix，10μl步骤a中的反应液，加rnasefreedh2o至20μl。反转录参数：37℃15min，85℃5s，4℃∞，反应结束置于-20℃冻存备用。(3)实时荧光定量pcr按照premixextaqtm(tlirnasehplus)(real-timepcr试剂盒，takara，宝生物工程(大连)有限公司)方法步骤完成。20μl反应体系是由10.0μlpremixextaqtm(2×)、0.4μlroxreferencedyeii(10×)、2.0μlcdna、6.8μlrnasefreedh2o、0.4μl上游引物(10μmol/l)、0.4μl下游引物(10μmol/l)组成。使用abi7500real-timepcr仪(appliedbiosystems公司)进行扩增。循环参数：首先在95℃30s；随后进行95℃5s，60℃34s，40个循环。每份样本做3个重复。相对荧光定量pcr数据的计算采用2-δδct法，以3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)为内参基因。各基因的mrna相对表达量以相对于生理盐水组表达量的倍数来表示。根据已发表的猪的rip1、rip3、mlkl和pgam5和gapdh的基因序列设计real-timepcr引物。利用primerpremier5.0软件设计，由宝生物工程(大连)有限公司合成，相关基因的引物序列见表3，仔猪肝脏细胞程序性坏死关键因子rip1、rip3、mlkl和pgam5mrna表达测定结果如表4所示。本试验的各基因扩增效率均接近100％。表3实施例6中引物序列表4lps对程序性坏死关键基因mrna表达的影响对照组lps组p值rip11.00±0.093.21±0.440.001rip31.00±0.110.91±0.170.667mlkl1.00±0.1516.15±2.000.001pgam51.00±0.103.82±0.34<0.001其中，rip1是程序性细胞坏死关键调控因子，对程序性细胞坏死有重要作用。mlkl形成三聚体并从胞浆易位到细胞质膜上，促进ca2+内流，导致细胞肿胀，最终发生坏死。pgam5的激活则可以导致成串排列的线粒体发生线性断裂，这一现象在细胞坏死发生的早期起到了非常重要的作用。结合上述机理及表4中的测定结果可知，与对照组相比，lps刺激显著提高了仔猪肝脏rip1、mlkl和pgam5mrna的表达(p＜0.05)。因此，本试验结果说明，对试验仔猪进行lps刺激4h后，导致仔猪肝脏细胞发生程序性坏死。实施例7lps刺激对仔猪肝脏细胞程序性坏死关键因子rip1、rip3、mlkl蛋白表达的影响肝脏程序性坏死关键因子rip1、rip3、mlkl的蛋白表达采用westernblot分析，方法同实例5。一抗分别为兔源rip1抗体(lifespanbiosciences公司，1:1000稀释)、兔源rip3抗体(santacruzbiotechnology公司，1：1000稀释)、兔源总mlkl抗体(cellsignalingtechnology公司，1：1000稀释)和兔源磷酸化mlkl抗体(cellsignalingtechnology公司，1：1000稀释)。内参均鼠源β-actin抗体(a2228，sigma公司，1：1000稀释)。rip1、rip3、总mlkl和磷酸化mlkl二抗为羊抗兔igg-hgp(武汉安特捷生物技术有限公司)，所有二抗均以1：5000稀释。rip1和rip3蛋白水平分别以rip1和rip3的条带强度与β-actin的条带强度比值表示，总mlkl蛋白水平以任意单位表示，磷酸化mlkl蛋白水平以磷酸化mlkl的条带强度与总mlkl的条带强度比值表示。结果如表5所示。表5lps对程序性坏死关键因子蛋白表达的影响对照组lps组p值rip1/β-actin0.874±0.0460.828±0.0440.475rip3/β-actin1.77±0.171.90±0.240.666t-mlkl,arbitraryunits32.2±2.132.0±2.40.929p-mlkl/t-mlkl1.16±0.071.38±0.040.010mlkl的磷酸化可促进线粒体分裂因子—磷酸甘油酸变位酶5(pgam5)的聚集并使之磷酸化。pgam5作用于线粒体裂解蛋白—动力相关蛋白1(drp1)，使之去磷酸化而激活，引发线粒体的断裂和活性氧(ros)的产生，最终导致细胞坏死。结合上述机理及表5中的测定结果可知，与对照组相比，lps刺激导致仔猪肝脏p-mlkl/t-mlkl显著上升(p＜0.05)。因此，本试验结果说明，对试验仔猪进行lps刺激4h后，导致仔猪肝脏细胞发生程序性坏死。实施例8lps刺激对仔猪肝脏炎性因子mrna表达的影响tnf-α(肿瘤坏死因子-α)、il-6(白细胞介素6)、cox2(环氧合酶2)和hsp70(热休克蛋白70)mrna的表达水平采用realtimepcr分析，方法同实例6，引物序列如表6所示，测定结果如表7所示。表6实施例8中引物序列表7lps对炎性因子mrna表达的影响对照组lps组p值tnf-α1.00±0.074.70±0.37<0.001il-61.00±0.1429.59±6.150.001cox21.00±0.216.51±1.090.001hsp701.00±0.14126.71±20.10<0.001在炎性刺激状态下，枯否细胞(肝脏巨噬细胞)会产生并释放大量炎性细胞因子，如tnf-α、cox2、il-6和hsp70等。hsp70是典型的抗炎因子，当炎性介质含量增加时，hsp70的含量也会相应的增加，以抑制炎性介质的过量产生，降低炎症反应。一方面，炎性因子(tnf-α)会诱导细胞发生程序性坏死。另一方面，当细胞发生程序性坏死时，细胞膜破裂，细胞内容物外泄，释放损伤相关分子样物质(damps)，进一步导致机体发生炎症反应。结合上述机理及表7中的测定结果可知，与对照组相比，lps刺激显著提高了炎性因子tnf-α、il-6、cox2和hsp70mrna的表达(p＜0.05)。说明对试验仔猪进行lps刺激4h后，导致仔猪肝脏发生炎性反应，诱导细胞发生程序性坏死。综上所述，本发明提供的脂多糖诱导仔猪肝脏细胞程序性坏死模型的建立方法，具有以下优点：(1)首次以肝脏细胞作为程序性坏死模型，这对研究肝脏细胞损伤的机制和治疗肝脏疾病具有重要理论和实践意义；(2)首次以活体动物(仔猪)作为建模对象，使得对肝脏损伤的研究更能结合实际。由于猪和人在体重和生理特征方面的高度相似性，因此该发明也便于研究者研究人类肝脏程序性坏死，从而为人类肝脏疾病的预防，以及相关药物的研究、开发和应用起到了非常重要的作用；(3)以脂多糖(lps)为诱导剂，诱导肝脏细胞的程序性坏死，具有诱导剂来源简便、价格便宜，建模方法简单且诱导时间短的特点；(4)在检验细胞是否程序性坏死方面，采用了直观的血清生化指标、肝脏组织形态结构、肝细胞超微结构，并结合检测细胞程序性坏死标志性蛋白(rip1、rip3和mlkl等)的mrna及蛋白的表达量，具有模型稳定、结果可靠、而且重复性好的优点，提高了细胞程序性坏死模型的稳定性，对深入研究肝脏损伤机制以及预防或治疗肝脏疾病的研究提供了新的途径和思路。以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12