本发明属于植物培育繁殖技术领域，具体的讲，涉及圆柏消毒、芽诱导、芽增殖及生根培养的方法。
背景技术：
圆柏(sabinachinensis(l.)ant.)又称桧柏、刺柏、珍珠柏，属柏科(cupressceae)圆柏属(sabina)。其材质结构致密，耐腐，可作建筑、文具、文艺品等用材。树干和枝叶可提取柏木脑和柏香油，枝叶可入药。其寿命长，终年常绿，树姿优美，为常见观赏树种。圆柏繁殖方式有播种繁殖、扦插繁殖、压条繁殖和嫁接繁殖。而目前，播种繁殖是圆柏的主要繁殖方式，圆柏种子种皮坚硬致密，不易透水，其胚需后熟才能发育，所以播种前必须进行长时间催芽处理，如不经处理播下的种子第2年才萌发出土。播种繁殖易发生变异，繁殖系数低，繁殖周期长且长势缓慢，不能满足市场的需求。利用组织培养技术可以保持亲本的优良特性，并在短期内大量繁殖。目前，圆柏组织培养仅有1例报道，辜夕容等以5年生圆柏幼嫩茎段为外植体，通过芽诱导、增殖及生根培养获得了圆柏的再生苗。但存在增殖系数低，试管苗生根率较低等问题。本发明以圆柏树冠中上部1年茎段作为外植体，经过培养基和生长调节物质的筛选，提高了芽诱导率，增值率和生根率，为圆柏的快速繁殖、大量育苗提供参考依据。
技术实现要素：
本发明为了解决运用组织培养技术实现圆柏的育苗问题，以圆柏树冠中上部1年生茎段作为外植体，以1/2ms、wpm等基本培养基附件不同浓度6-ba、naa、iba来诱导芽、芽增殖及生根炼苗，并提供一种诱导、继代及生根时的方法及培养条件，以实现植株再生和快速繁殖。
本发明目的实现由以下技术方案完成：
本发明包括以下步骤：
(1)取圆柏树冠中上部1年生茎段，用洗衣粉刷洗干净表面灰尘杂物，再用清水冲洗干净，将洗净后外植体剪成3～5cm小段，置于烧杯中，流水冲洗8h。在超净工作台中，先用无菌水将茎段冲洗3次，用75％酒精消毒1min后再用无菌水清洗5次，再用0.1％升汞消毒9min，然后用无菌水冲洗5次。
(2)将经步骤(1)处理过的茎段置于无菌滤纸上，晾干后切去少许外植体切口后，切成1.5～2.0cm长茎段，接种于下列培养基中：1/2ms培养基+(0.1～1.0mg/l)6-ba+(0.1～1.0mg/l)naa+30g/l蔗糖+6g/l琼脂，ph控制在5.8～6.0、温度为25±2℃、光照强度为1500～2200lx、光照时间为12h/d的条件下进行诱导培养。接种20d后，腋芽和顶芽处即萌出约2mm长的绿色小芽，部分茎段基部膨大，培养30d时，转到相同培养基中继续培养。
(3)当步骤(2)中茎段节间明显伸长，切割茎段接种到下列培养基中：1/2ms培养基+(0.1～0.5mg/l)6-ba+(0.1～0.5mg/l)naa+(0.1～0.3mg/l)iba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂。ph控制在5.8～6.0、温度为25±2℃、光照强度为1500～2200lx、光照时间为12h/d的条件下进行芽增殖培养。
(4)当步骤(3)中芽明显伸长后置于下列培养基中：1/2ms+(0.1～1.0mg/l)naa+(0.1～1.0mg/l)iba+15g/l蔗糖+6g/l琼脂，wpm+(0.1～1.0mg/l)naa+(0.1～1.0mg/l)iba+15g/l蔗糖+6g/l琼脂，ph控制在5.8～6.0、温度为25±2℃、光照强度为1500～2200lx、光照时间为12h/d的条件下进行生根培养45d，得到生根苗。
(5)将步骤(4)中生根苗先揭开三角瓶瓶口在培养室内放置3d，然后用镊子取出植株，洗掉根部附着的培养基，栽于灭菌的蛭石+砂土(1∶2)的基质中，适当遮阴，精心管理，浇以少量1/4ms营养液，30d后得到可移栽圆柏苗。
本发明的优点是选用适当的消毒剂和消毒时间，外植体消毒效果好，降低了污染率。采用适宜的培养基和培养条件提高了增殖系数、生根率和成活率，缩短了育苗周期，提高了幼苗质量，为建立快速、稳定、高效并能普遍适用的圆柏快繁体系奠定了基础。
具体实施方案：
实施例1
(1)取圆柏树冠中上部1年生茎段，用洗衣粉刷洗干净表面灰尘杂物，再用清水冲洗干净，将洗净后外植体剪成3～5cm小段，置于烧杯中，流水冲洗8h。在超净工作台中，先用无菌水将茎段冲洗3次，用75％酒精消毒1min后再用无菌水清洗5次，再用0.1％升汞消毒9min，然后用无菌水冲洗8次。
(2)将经步骤(1)处理过的茎段置于无菌滤纸上，晾干后切去少许外植体切口后，切成约2.0cm长茎段，接种于下列培养基中：1/2ms培养基+0.5mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+6g/l琼脂，ph为5.8、温度为25℃、光照强度为2200lx、光照时间为12h/d的条件下进行诱导培养。接种20d后，腋芽和顶芽处即萌出约2mm长的绿色小芽，部分茎段基部膨大，培养30d时，转到相同培养基中继续培养。
(3)当步骤(2)中茎段节间明显伸长，切割茎段接种到下列培养基中：1/2ms培养基+0.3mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+0.1mg/liba+30g/l蔗糖+6g/l琼脂。ph为5.8、温度为25℃、光照强度为2200lx、光照时间为12h/d的条件下进行芽增殖培养。
(4)当步骤(3)中试管芽明显伸长后置于下列培养基中：1/2ms+0.5mg/lnaa+0.5mg/liba+15g/l蔗糖+6g/l琼脂，ph为5.8、温度为25℃、光照强度为1500lx、光照时间为12h/d的条件下进行生根培养45d，得到生根苗。
(5)将步骤(4)中生根苗先揭开三角瓶瓶口在培养室内放置3d，然后用镊子取出植株，洗掉根部附着的培养基，栽于灭菌的蛭石+砂土(1∶2)的基质中，适当遮阴，精心管理，浇以少量1/4ms营养液，30d后得到可移栽圆柏苗。
本发明方法外植体消毒后污染率为2.22％，芽诱导率为96.67％，芽增殖率为100％，芽增殖系数为8.9，芽生根率为75％。
虽然以上对本发明目的的构思和实施例作了详尽说明，但本领域普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的前提条件下，仍然可以对本发明作出各种改进和变换，而这种改进和变换仍然应当属于本发明的保护范围。