倍半萜类衍生物在制备防治小麦赤霉病药物中的应用

本申请是申请日为2020年2月13日，申请号为202010090869.5、发明名称为《倍半萜类化合物及其衍生物在制备防治小麦赤霉病药物中的应用》的分案申请，申请人为贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室(贵州医科大学天然产物化学重点实验室)。

本发明涉植物病害防治技术领域，尤其涉及倍半萜类衍生物在制备防治小麦赤霉病药物中的应用。

背景技术：

小麦作为我国主要粮食作物之一，种植面积仅次于水稻，小麦赤霉病(fusariumgraminearum，俗称麦穗枯、烂麦头、红麦头)是我国小麦高品质生产上危害最大的病害。目前防治小麦赤霉病的发生主要以化学农药为主，化学农药具有很多副作用，比如，咪鲜胺为一种应用广泛的化学杀菌剂，但有研究发现它的某些代谢物(如2,4,6-三氯苯氧基乙酸等)具有致癌性、致突变性、致癌性和有毒性，且为环境污染物。

植物活性天然产物因对人畜安全、与生态环境相容、高效低毒，已成为农药开发的主要方向之一。

倍半萜(sesquiterpenes)是指分子中含15个碳原子的天然萜类化合物，含有三个异戊二烯单元，具有链状、环状等多种骨架结构。倍半萜多为液体，主要存在于植物的挥发油中，倍半萜的衍生物种类也很多，如醇、酮、内酯等衍生物也广泛存在于挥发油中，此外还可以以天然倍半萜类化合物为原料制备倍半萜类衍生物。本领域已经发现倍半萜类化合物及其衍生物在抗菌、抗肿瘤方面有一定的活性，但是至今为止，尚没有关于将倍半萜类化合物应用于小麦赤霉病防治中的相关研究报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了倍半萜类化合物及其衍生物在制备防治小麦赤霉病药物中的应用。本发明提供的倍半萜类化合物及倍半萜类衍生物对小麦赤霉具有明显的抑菌活性，能够应用于制备防治小麦赤霉病药物中。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

倍半萜类化合物及倍半萜类衍生物在制备防治小麦赤霉病药物中的应用，所述倍半萜类化合物具有式1～8所示结构中的任意一种：

所述倍半萜类衍生物具有式9或式10所示结构：

优选的，所述药物的剂型包括粉剂、悬浮剂、颗粒剂、水分散剂或微乳剂。

优选的，所述具有式10所示结构的倍半萜类衍生物的制备方法包括以下步骤：

(1)将莪术醇和溶剂混合后通入臭氧进行反应，得到具有式z-1所示的中间体；

(2)将1-丁基-3-甲基咪唑二(三氟甲基磺酰)酰亚胺、具有式z-1所示结构的中间体、多聚甲醛和二异丙基胺三氟乙酸盐混合进行反应，得到具有式z-2所示结构的中间体；

(3)在碱性催化剂作用下，将具有式z-2所示结构的中间体和氯乙酸酐进行反应，得到具有式10所示结构的倍半萜类衍生物。

优选的，所述步骤(1)中臭氧的通入量为莪术醇摩尔量的10～20倍；所述步骤(1)中反应的温度为室温。

优选的，所述步骤(2)中具有式z-1所示结构的中间体、多聚甲醛和二异丙基胺三氟乙酸盐的摩尔比为1：1:1～2:1:1；所述步骤(2)中反应的温度为60-80℃。

优选的，所述步骤(3)具有式z-2所示结构的中间体和氯乙酸酐的摩尔比为1:1.5～3；所述步骤(3)中反应的温度为室温。

优选的，所述碱性催化剂包括无机碱或有机碱；所述无机碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钾和氢化钠中的一种或几种；所述有机碱包括n,n'-二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯中的一种或几种。

本发明还提供了一种倍半萜类衍生物，具有式10所示结构。

本发明提供了倍半萜类化合物及倍半萜类衍生物在制备防治小麦赤霉病药物中的应用，所述倍半萜类化合物具有式1～8所示结构中的任意一种，倍半萜类衍生物具有式9或式10所示结构。本发明研究发现式1～8所示结构的倍半萜类化合物以及式9～式10所示结构的倍半萜类衍生物均对小麦赤霉具有明显的抑菌活性，将其应用于制备防治小麦赤霉病药物中，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为不同浓度的莪术油粗品对小麦赤霉的抑菌活性结果；

图2为不同浓度的具有式7所示结构的倍半萜类化合物以及多菌灵对小麦赤霉的抑菌活性结果。

具体实施方式

本发明提供了倍半萜类化合物及倍半萜类衍生物在制备防治小麦赤霉病药物中的应用，所述倍半萜类化合物具有式1～8所示结构中的任意一种：

具有式1～式8所示结构的化合物为天然倍半萜类化合物，本发明对式1～式8所示结构的倍半萜类衍生物的来源没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法进行分离提取即可，在本发明的具体实施例中，所述式1～式8所示结构的倍半萜类衍生物优选从莪术油中分离得到。

在本发明中，所述倍半萜类衍生物具有式9或式10所示结构：

在本发明中，具有式9或式10所示结构的倍半萜类衍生物是以天然产物莪术醇(具有式6所示结构倍半萜类化合物)为原料制备得到的衍生物，又可成为莪术醇衍生物；本发明对式9所示结构的倍半萜类衍生物的来源没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法制备即可。

在本发明中，所述具有式10所示结构的倍半萜类衍生物的制备方法优选包括以下步骤：

(1)将莪术醇和溶剂混合后通入臭氧进行反应，得到具有式z-1所示的中间体；

(2)将1-丁基-3-甲基咪唑二(三氟甲基磺酰)酰亚胺、具有式z-1所示结构的中间体、多聚甲醛和二异丙基胺三氟乙酸盐混合进行反应，得到具有式z-2所示结构的中间体；

(3)在碱性催化剂作用下，将具有式z-2所示结构的中间体和氯乙酸酐进行反应，得到具有式10所示结构的倍半萜类衍生物。

在本发明中，所述具有式10所示结构的倍半萜类衍生物的合成路线如式a所示：

本发明将莪术醇和溶剂混合后通入臭氧进行反应，得到具有式z-1所示结构的中间体。在本发明中，所述溶剂优选为二氯甲烷(dcm)、氯仿和苯中的一种或几种；本发明对溶剂的用量没有特殊要求，能够保证反应顺利进行即可；本发明优选先将莪术醇和溶剂混合后搅拌15min，然后再通入臭氧；在本发明中，所述臭氧的通入量优选为莪术醇摩尔量的10～20倍；所述步骤(1)中反应的温度优选为室温，本发明对所述反应的时间没有特殊要求，在本发明的具体实施例中，优选使用tcl跟踪至反应完全。

步骤(1)反应完成后，本发明优选将所述产物料液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

将所得产物料液和二甲硫醚混合后搅拌，然后依次使用饱和亚硫酸钠和饱和食盐水洗涤，之后使用二氯甲烷萃取，将二氯甲烷相干燥后减压浓缩，得到粗产物；

将所述粗产物进行柱色谱纯化，得到具有式z-1所示结构的中间体。

本发明对所述二甲硫醚的加入量没有特殊要求，能够将产物料液中残留的臭氧完全去除即可；所述二氯甲烷相干燥用干燥剂优选为无水硫酸钠；所述柱色谱纯化用洗脱液优选为石油醚和乙酸乙酯的混合液；所述混合液中石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为10:1。

得到具有式z-1所示结构的中间体后，本发明将1-丁基-3-甲基咪唑二(三氟甲基磺酰)酰亚胺、具有式z-1所示结构的中间体、多聚甲醛和二异丙基胺三氟乙酸盐(i-pr2nh·tfa)混合进行反应，得到具有式z-2所示结构的中间体((3s,3as,5s,6r,8ar)-3-甲基-5-异丙基-7-甲烯基-8h-3a,6-环氧莪术-6-醇-8-酮)。在本发明中，所述具有式z-1所示结构的中间体、多聚甲醛和二异丙基胺三氟乙酸盐的用量比优选为1:1:1～2:1:1；所述1-丁基-3-甲基咪唑二(三氟甲基磺酰)酰亚胺和具有式z-1所示结构的中间体的用量比优选为1ml：0.08mmol；在本发明中，所述二异丙基胺三氟乙酸起到催化剂的作用，所述1-丁基-3-甲基咪唑二(三氟甲基磺酰)酰亚胺起到反应溶剂的作用，能够将难溶的多聚甲醛溶解，同时还能在反应过程中与催化剂共同作用于羰基a位上的氢，使甲醛作用于z-1所示结构中的羰基a位上，最后脱水生成双键。在本发明中，所述步骤(2)中反应的温度优选为60～80℃，更优选为70℃，本发明对所述反应的时间没有特殊要求，在本发明的具体实施例中，优选使用tcl跟踪至反应完全。

步骤(2)反应完成后，本发明优选优选将所述产物料液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

将所得产物料液依次使用盐酸水溶液、氢氧化钠水溶液和饱和食盐水洗涤，然后使用无水硫酸钠干燥后减压浓缩至干，得到具有式z-2所示结构的中间体。

在本发明中，所述盐酸水溶液的浓度优选为1mol/l，氢氧化钠水溶液的浓度优选为1mol/l。

得到具有式z-2所示结构的中间体后，本发明在碱性催化剂作用下，将具有式z-2所示结构的中间体和氯乙酸酐进行反应，得到具有式10所示结构的倍半萜类衍生物。在本发明中，所述碱性催化剂优选包括无机碱或有机碱；所述无机碱优选包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钾和氢化钠中的一种或几种；所述有机碱优选包括n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)，4-二甲氨基吡啶(dmap)和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)中的一种或几种；在本发明的具体实施例中，所述碱性催化剂最优选为氢化钠；所述碱性催化剂和具有式z-2所示结构的中间体的摩尔比优选为1:1；所述具有式z-2所示结构的中间体和氯乙酸酐的摩尔比为1:1.5～3，更优选为1:2.5。

在本发明中，所述步骤(3)的溶剂优选为二氯甲烷、氯仿和苯中的一种或几种，更优选为二氯甲烷；在本发明的具体实施例中，优选先将碱性催化剂、具有z-2所示结构的中间体和溶剂混合后室温搅拌30min，使碱性催化剂和具有z-2所示结构的中间体半缩醛上的羟基形成中间体，然后再加入氯乙酸酐进行反应。在本发明中，所述步骤(3)中反应的温度为室温，本发明对所述反应的时间没有特殊要求，在本发明的具体实施例中，优选使用tcl跟踪至反应完全。

步骤(3)反应完成后，本发明优选将所述产物料液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：

向反应液中加水将反应淬灭，得到产物料液；

将所述产物料液依次进行洗涤、干燥和减压浓缩，将浓缩产物进行柱色谱纯化，得到具有式10所示结构的倍半萜类衍生物。

在本发明中，所述洗涤优选为依次使用酒石酸和饱和食盐水进行洗涤，所述干燥优选为使用无水硫酸钠干燥，所述柱色谱纯化用洗脱液优选为石油醚和乙酸乙酯的混合液；所述混合液中石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为100:1。

本发明研究发现式1～式8所示结构的倍半萜类化合物以及式9～式10所示结构的倍半萜类衍生物均具有不同程度的抗小麦赤霉病菌的活性，其中具有式7、式8所示结构的倍半萜类化合物以及具有式9和式10所示结构的倍半萜类衍生物抗小麦赤霉病菌的活性较强。

在本发明中，所述药物的剂型优选包括粉剂、悬浮剂、颗粒剂、水分散剂或微乳剂；所述药物的组成成分包括活性成分和载体，所述活性成分为具有式1～式10所示结构的化合物；本发明对所述载体的种类没有特殊要求，根据具体的药物剂型进行选择、使用本领域技术人员熟知的载体即可。

本发明还提供了一种倍半萜类衍生物，具有式10所示结构，本发明提供的具有式10所示结构的倍半萜类衍生物是一种新型的倍半萜类衍生物，且抗小麦赤霉病菌的活性较强。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。

以下实施例中用到的小麦赤霉病菌由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室提供；莪术油粗品购自江西吉安市青原区友才天然香料油有限公司，式1～式8所示结构的倍半萜类化合物从莪术油中分离得到。

实施例1

菌种的活化：采用接种环，刮取3环菌种接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)上，28±1℃恒温培养72小时。

采用毒力平板法评价化合物的抑菌作用，具体步骤如下：用打孔器(直径为ф4mm)分别在已活化好的小麦赤霉病菌的pda平板上打取直径为5mm的菌饼，然后分别加入活性物质(具有式1～式8所示结构的倍半萜类化合物)及对照物质(阴性对照莪术油粗品，阳性对照多菌灵)至平板中央，每个处理6次重复，取平均值。28±1℃恒温培养48h以上，观察抑菌情况。用十字交叉法测菌饼直径，按照式b计算出具体抑制率，然后根据梯度浓度下的不同抑制率，计算ec50值。

i(％)＝(c-t)/(c-5mm)×100％式b；

式b中：i为活性物质抑制率，c为空白对照菌饼生长直径，t为毒力平板上菌饼生长直径。

所得实验结果如下：

(1)不同浓度的莪术油粗品对小麦赤霉的抑菌活性见图1，图1中1～4的莪术油粗品浓度为：1)空白组；2)0.5mg/ml；3)1mg/ml；4)2mg/ml；莪术油粗品抑制小麦赤霉病菌的ec50值为880μg/ml。

(2)式1～式8所示结构的倍半萜类化合物(记为化合物1～8)在50μg/ml时对小麦赤霉病菌菌丝的抑制率见表1：

表1式1～式8所示结构的倍半萜类化合物在50μg/ml时对小麦赤霉病菌菌丝的抑制率(n＝6，)

根据表1可以看出，在50μg/ml的浓度下，式1～式8所示结构的倍半萜类化合物对小麦赤霉病菌均显示出一定的抑制作用。

(3)对化合物进行ec50值的测定发现，具有式7所示结构的倍半萜类化合物在200μg/ml时对小麦赤霉病菌的抑制效果与阳性对照药多菌灵在2μg/ml时效果一致，检测效果如图2所示；图2为不同浓度的具有式7所示结构的倍半萜类化合物以及多菌灵对小麦赤霉的抑菌活性结果，其中a为具有式7所示结构的倍半萜类化合物在不同浓度下对小麦赤霉病菌的抑制情况，其中1)空白组，2)12.5μg/ml，3)25μg/ml，4)50μg/ml，5)100μg/ml，6)200μg/ml；b为多菌灵在不同浓度下对小麦赤霉病菌的抑制情况，其中1)空白组，2)0.125μg/ml，3)0.25μg/ml，4)0.5μg/ml，5)1μg/ml，6)2μg/ml。

(3)测试不同浓度下莪术油粗品、式7～式8所示结构的倍半萜类化合物及阳性对照药多菌灵对小麦赤霉病菌的抑制活性，通过ld50数据处理程序，分别得到莪术油粗品、式7～式8所示结构的倍半萜类化合物以及多菌灵的ec50值，结果见表2。

表2化合物的ec50值

根据表2中的数据可以看出，具有式7和式8所示结构的倍半萜类化合物对小麦赤霉病菌的抑制活性明显优于莪术油粗品。

实施例2

具有式9所示结构的倍半萜类衍生物的制备：

反应式如下：

取丙酮(30ml)、40％的氢溴酸溶液(5ml)加入50ml反应瓶中混合，然后加入脱水剂(无水硫酸钠、无水碳酸钠、五氧化二磷等脱水剂)进行脱水处理，过滤，得滤液(无水丙酮-氢溴酸混合溶液)，取100mg莪术醇加入此滤液中，加热回流，tlc跟踪直至反应完全，加入饱和碳酸氢钠溶液中和体系中过量的溴化氢，加入乙酸乙酯萃取3次，合并滤液，经无水硫酸钠干燥后减压浓缩得粗品，经柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)得35mg白色固体(具有式9所示结构的倍半萜类衍生物，中文名称为：2,7-二异丙基-1,4-二甲基-2,3-二氢环戊烷并环庚三烯-6(1h)-酮)。

所得产物的结构及波谱数据如下：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.08(s,1h,h-6),7.00(s,1h,h-9),3.46(p,j＝6.9hz,1h,h-11),3.07(p,j＝7.2hz,1h,h-4),2.81(dd,j＝16.7,7.7hz,1h,h-2),2.54(dd,j＝16.7,11.5hz,1h,h-2),2.22(s,3h,h-14),1.92(s,1h,h-3),1.76–1.69(m,1h,h-16),1.18(s,3h,h-15),1.16(d,j＝3.1hz,3h,h-12orh-13),1.03(s,3h,h-12orh-13),0.99(d,j＝2.0hz,3h,h-17orh-18),0.98(d,j＝2.2hz,3h,h-17orh-18).esi-ms:[m+na]⁺:281.1。

实施例3

具有式10所示结构的倍半萜类衍生物的制备：

取100mg莪术醇加入50ml反应瓶中，然后加入20mldcm，-78℃，搅拌15min，向反应体系中通入臭氧，tlc跟踪至反应完全，反应完全，加入0.2ml二甲硫醚，室温搅拌3h后，依次用饱和亚硫酸氢钠，饱和食盐水洗，依次同时加入dcm萃取，无水硫酸钠干燥dcm后减压浓缩，得粗品，经柱色谱(石油醚：乙酸乙酯10：1)得无色透明液体(z-1，48mg，收率48％)。

取2ml1-丁基-3-甲基咪唑二(三氟甲基磺酰)酰亚胺，z-1(19mg，0.08mmol)，多聚甲醛(5mg，0.16mmol)及催化剂i-pr2nh·tfa(18mg，0.08mmol)，70℃下反应，tlc跟踪至反应完全，用1n的盐酸水溶液，1n的氢氧化钠水溶液，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，刮板，得白色固体z-2(17mg，(3s,3as,5s,6r,8ar)-3-甲基-5-异丙基-7-甲烯基-8h-3a,6-环氧莪术-6-醇-8-酮，收率85％)。

在50ml反应瓶中，加入20mldcm做溶剂，加入z-2(300mg，1.27mmol)及nah(305mg，12.7mmol)，室温搅拌30min，随后加入氯乙酸酐(543mg，3.2mmol)，室温搅拌，tlc跟踪至反应完全，加水淬灭，依次用饱和酒石酸，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，经柱色谱(石油醚：乙酸乙酯＝100：1)得257mg无色透明液体(具有式10所示结构的倍半萜类衍生物，收率65％)。

所得产物结构及波谱数据如下：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.36(s,1h，h-1”),5.61(s,1h，h-1”),4.10(s,2h，h-2'),1.05(d,j＝6.2hz,3h，h-12),0.91(t,j＝6.2hz,6h,h-10and11)，2.52(ddd,j＝13.3,9.4,5.3hz,2h),2.36(t,j＝12.4hz,1h),2.15–1.81(m,4h),1.60–1.53(m,1h),1.45–1.30(m,2h)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ199.10(c-8),163.30(c-1'),140.91(c-7),121.65(c-1”),108.94(c-6),87.87(c-3a),59.68(c-8a),53.26(c-2'),41.55(c-3),40.93(c-7),33.85(c-4),30.86(c-2),29.18(c-9),27.07(c-1),22.20(c-10),20.66(c-11),11.36(c-12).esi-ms:[m+na]⁺:349.0。

实施例4

按照实施例1中的方法测试具有式9和式10所示结构的倍半萜类衍生物对小麦赤霉病菌的抑制活性，所得结果见表3～表4。

表3不同浓度下式9和式10所示结构的倍半萜类衍生物对小麦赤霉病菌的抑制率

根据表2可以看出，在不同的浓度下，具有式9和式10所示结构的倍半萜类衍生物对小麦赤霉病菌均有一定的抑制活性，并且在浓度为50μg/ml时，具有式9所示结构的倍半萜类衍生物对小麦赤霉病菌的抑制率可以达到55.42％，具有式10所示结构的倍半萜类衍生物对小麦赤霉病菌的抑制率可以达到72.75％。

根据梯度浓度下的不同抑制率，以药物剂量为横坐标，以抑制率为纵坐标得到毒力回归方程，并计算ec50值，结果见表4。

表4具有式9和式10所示结构化合物的ec50值

根据表4可以看出，具有式9和式10所示结构的倍半萜类衍生物抑制小麦赤霉病菌的ec50值均较低，说明其对小麦赤霉病菌具有较高的抑制活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。