罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法与流程

1.本发明涉及植物组织培养，涉及罗汉果的组织培养方法，具体涉及罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法。


背景技术：

2.罗汉果病毒病在罗汉果主栽区非常普遍，是危害罗汉果产量和品质的最大病害，罗汉果无毒苗通过茎尖脱毒获得，而且一般需要采用小于0.5毫米大小的茎尖培养才能有效再生出脱毒苗。采用小于0.5毫米大小茎尖培养的问题是其再生成苗时间较长，一般需要2个多月才能得到正常小苗，得到正常可移栽用的带根种苗至少需要3-4个月时间，大大影响了罗汉果脱毒组培苗在生产上的应用。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，建立了茎尖微嫁接培养技术，在确保茎尖培养脱毒效率的同时，大大缩短了获得脱毒苗的时间。
4.本发明的目的通过以下技术方案来实现：罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，以无毒罗汉果组培苗茎段作为砧木，取罗汉果带毒组培苗的等于小于0.5mm茎尖为接穗，嫁接于所述砧木，培养至成幼苗。
5.进一步地，所述茎尖经包埋液包埋处理后再接种至砧木上，所述包埋液主要含有海藻酸钠。作为本发明的实施，所述包埋材料至少包含2.5-3.5％海藻酸钠和0.1-0.2mol/l cacl2。进一步地，所述包埋材料至少包含2.5-3.5％海藻酸钠、25-35g/l蔗糖和0.1-0.2mol/l cacl2。更进一步地，所述包埋材料至少包含2.5-3.5％海藻酸钠、25-35g/l蔗糖、0.1-0.2mol/l cacl2和无cacl2的ms培养基。
6.所述砧木为罗汉果无毒种苗切去第一个节及以上部分，所留下的茎段部分。
7.所述接穗为罗汉果带病毒组培苗在含有bap 0.1-0.5mg/l和naa 0.01-0.05mg/l的ms培养基上培养2-3周获得。
8.所述砧木组培苗为罗汉果无毒种苗在含有bap 0.1-0.5mg/l和naa 0.01-0.05mg/l的ms培养基上培养3-4周获得砧木组培苗。
9.本发明所述的培养为在28℃光照条件下培养。
10.本发明的优点：
11.1.本发明通过把罗汉果等于小于0.5毫米离体茎尖在组培阶段嫁接到无毒组培苗砧木上培养生长，建立了茎尖微嫁接培养技术，在确保茎尖培养脱毒效率的同时，大大缩短了获得再生脱毒种苗的时间。研究结果显示，本发明提供的方法在培养21天左右可获得足够大小的1-1.5厘米高度再生种苗，用于病毒检测。
12.2.本发明所述茎尖经过海藻酸钠包埋后进行嫁接，有效地提高微嫁接幼苗再生率。
13.3.本发明获得的再生脱毒种苗生长快而且长势健壮，确保后期更快生根以及随后
的移栽生长，其生根时间可缩短至2-3周。
附图说明
14.图1为罗汉果茎尖大小对再生幼苗生长的影响。
15.图2为实施例一至三的茎尖包埋微嫁接培养与常规茎尖培养再生幼苗生长比较(培养15天)。
16.图3为实施例一至三的茎尖包埋微嫁接培养与常规茎尖培养再生幼苗生长比较(培养30天)。
具体实施方式
17.实施例一
18.将罗汉果带病毒组培苗在含有bap0.5mg/l和naa0.05mg/l的ms培养基上培养2-3周获得接穗带毒组培苗。
19.将罗汉果无毒种苗在在含有bap0.5mg/l和naa0.05mg/l的ms培养基上培养3-4周获得砧木组培苗。
20.取砧木无毒组培苗，切去第一个节及以上部分，剩下茎段作为砧木，侧面用解剖刀切割形成契形切口。
21.在体视显微镜下从培养2-3周的接穗带毒组培苗上剥取小于0.5mm茎尖。将茎尖嫁接至以上砧木的契形切口处。
22.配置含3％海藻酸钠和30g/l蔗糖的无cacl2的ms培养基和0.1mol/l cacl2作为包埋液。将茎尖采用包埋液包埋后嫁接至以上砧木的契形切口处。
23.微嫁接处理完后转至含有bap0.5mg/l和naa0.05mg/l的ms培养基上，培养物转移至培养室，在28℃光照条件下培养，培养21天，再生得到生长健壮的幼苗，继续培养至60天。
24.实施例二
25.与实施例一不同的是：
26.配置含3％海藻酸钠、30g/l蔗糖和0.1mol/l cacl2的包埋液。
27.实施例三
28.与实施例一不同的是：
29.配置含3％海藻酸钠和0.1mol/l cacl2的包埋液。
30.实施例四
31.将罗汉果带病毒组培苗在含有bap0.5mg/l和naa0.05mg/l的ms培养基上培养2-3周获得接穗带毒组培苗。
32.将罗汉果无毒种苗在含有bap0.5mg/l和naa0.05mg/l的ms培养基上培养3-4周获得砧木组培苗。
33.取砧木无毒组培苗，切去第一个节及以上部分，剩下茎段作为砧木，侧面用解剖刀切割形成契形切口。
34.在体视显微镜下从培养2-3周的接穗带毒组培苗上剥取小于0.5mm茎尖。将茎尖嫁接至以上砧木的契形切口处。
35.微嫁接处理完后转至含有bap0.5mg/l和naa0.05mg/l的ms培养基成后，培养物转
移至培养室，在28℃光照条件下培养，培养21天后得到健康再生幼苗，继续培养至60天。
36.实施例五
37.与实施例一不同的是：
38.在体视显微镜下从培养2-3周的接穗带毒组培苗上剥取长度为0.5mm茎尖。将茎尖嫁接至以上砧木的契形切口处。
39.对比例一 常规茎尖培养法
40.与实施例一不同的是：
41.在体视显微镜下从培养2-3周的接穗带毒组培苗上剥取小于0.5mm茎尖，直接接种到含有bap0.5mg/l和naa0.05mg/l的ms培养基上，在28℃光照条件下培养培养21天后得到健康再生幼苗，继续培养至60天。
42.对比例二
43.与实施例一不同的是：
44.在体视显微镜下从培养2-3周的接穗带毒组培苗上剥取1mm茎尖。
45.表1.微嫁接方式对幼苗再生率的影响
[0046][0047]
表2.微嫁接方式对再生幼苗生长的影响(培养30天)
[0048][0049]
图1显示，当嫁接的茎尖的长度等于小于0.5mm时，经过30天的培养，所得幼苗虽不如长度1mm的长得壮，但是能够在短时间内实现脱毒，大大缩短了获得罗汉果脱毒苗时间。图2-3显示，实施例一的茎尖经包埋后嫁接能够在培养15天内分化成苗，经30培养后，得到幼苗。而对比例一则是茎尖未经包埋直接在培养基中培养，需经30天培养才分化成苗。表1-2的结果显示，同样是茎尖嫁接，将包埋处理的成株率大大高于未经包埋处理的。由此可见，取培养2-3周的接穗带毒组培苗的等于小于0.5mm的茎尖经过包埋处理后再进行嫁接，不仅脱毒苗成苗时间短，而且成株率高，有利于提高罗汉果脱毒苗生产效率。


技术特征：
1.罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，其特征是，以无毒罗汉果组培苗茎段作为砧木，以带毒组培苗等于小于0.5mm的茎尖为接穗，嫁接于所述砧木，培养至成幼苗。2.根据权利要求1所述罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，其特征是，所述茎尖经包埋液包埋处理后再嫁接至砧木上，所述包埋液主要包含海藻酸钠。3.根据权利要求2所述罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，其特征是，所述包埋包埋液至少包含2.5-3.5％海藻酸钠和0.1-0.2mol/l cacl2。4.根据权利要求2所述罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，其特征是，所述包埋包埋液至少包含2.5-3.5％海藻酸钠、25-35g/l蔗糖和0.1-0.2mol/l cacl2。5.根据权利要求2所述罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，其特征是，所述包埋液至少包含2.5-3.5％海藻酸钠、25-35g/l蔗糖、0.1-0.2mol/l cacl2和无cacl2的ms培养基。6.根据权利要求1-5任一所述罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，其特征是，所述砧木为罗汉果无毒种苗切去第一个节及以上部分，所留下的茎段部分。7.根据权利要求6所述罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，其特征是，所述接穗为罗汉果带病毒组培苗在含有bap0.1-0.5mg/l和naa0.01-0.05mg/l的ms培养基上培养2-3周获得。8.根据权利要求6所述罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，其特征是，所述砧木组培苗为罗汉果无毒种苗在含有bap0.1-0.5mg/l和naa0.01-0.05mg/l的ms培养基上培养3-4周获得砧木组培苗。9.根据权利要求1-5任一所述罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，其特征是，所述的培养为在28℃光照条件下培养。

技术总结
本发明公开了罗汉果种苗茎尖微嫁接培养方法，以无毒罗汉果组培苗茎段作为砧木，以带毒组培苗等于小于0.5mm的茎尖为接穗，嫁接于所述砧木，培养至成幼苗。本发明通过把罗汉果等于小于0.5毫米离体茎尖在组培阶段嫁接到无毒组培苗砧木上培养生长，建立了茎尖微嫁接培养技术，在确保茎尖培养脱毒效率的同时，大大缩短了获得再生脱毒种苗的时间。缩短了获得再生脱毒种苗的时间。缩短了获得再生脱毒种苗的时间。


技术研发人员：张玉华 莫雪燕 李元元 周怡静 黄荣明 刘月 黄雪妹 刘彦雪
受保护的技术使用者：桂林莱茵生物科技股份有限公司
技术研发日：2021.07.30
技术公布日：2023/2/3