一种H3K9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大B淋巴瘤细胞增殖模型的构建方法与流程

一种h3k9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大b淋巴瘤细胞增殖模型的构建方法
技术领域
1.本发明涉及一种h3k9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大b淋巴瘤细胞增殖模型的构建方法，属于生物医药技术领域。
技术背景
2.弥漫大b细胞淋巴瘤（dlbcl）是非霍奇金淋巴瘤中最常见的类型，约占淋巴瘤的30%
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40%，其特征在于临床表现和预后的巨大异质性.随着基因表达谱及dna测序技术的发展，新的靶向药物如靶向细胞凋亡途径的药物、靶向b细胞受体途径的药物和靶向表观遗传调节因子的药物等越来越应用到dlbcl的临床治疗中。dlbcl患者的长期存活率显着改善，5年的整体生存率达到60％至70％，但仍有近30％的患者对一线标准治疗原发难治或治疗缓解后复发，生存期短，预后较差。所以需要寻找一种新的靶向药物治疗dlbcl。
3.组蛋白h3k9（dimethylatedhistoneh3lysine 9）甲基化修饰是发生在组蛋白h3的9位赖氨酸残基上的甲基化，与基因沉默相关。在肿瘤增殖过程中通过抑制抑癌基因的表达促进肿瘤细胞增殖。针对h3k9甲基化酶药物在淋巴瘤细胞凋亡诱导模型的建立有利于指导用药，给淋巴瘤患者的治疗提供指导，目前通过抑制h3k9甲基化酶的药物在抑制弥漫大b淋巴瘤细胞增殖建立方法还没有明确报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的就是针对上述现有技术的缺陷，提供一种h3k9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大b淋巴瘤细胞增殖模型的构建方法。
5.本发明的目的是这样实现的：一种h3k9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大b淋巴瘤细胞增殖模型的构建方法，其特征是，包括以下步骤：（1）、培养淋巴瘤细胞，培养淋巴瘤细胞的细胞培养液包括含10％胎牛血清的rpmi
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1640培养液，待淋巴瘤细胞生长至对数生长期后，向其中添加10mmol/l的h3k9甲基化酶抑制剂，放入37℃二氧化碳培养箱中培养；24小时后的淋巴瘤细胞更换无h3k9甲基化酶抑制剂的细胞培养液，继续放入37℃二氧化碳培养箱中培养；（2）、在小鼠皮下注射步骤（1）中h3k9甲基化酶抑制剂处理以后的淋巴瘤细胞，第24天处死小鼠，剥离瘤体，称重；（3）、收集步骤（2）小鼠肿瘤组织，rt
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qpcr检测肿瘤相关基因bcl
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2、bax和ki
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67的mrna表达量；验证h3k9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大b淋巴瘤细胞增殖模型的建立。
6.步骤（1）中，还包括：收集步骤（1）的培养的淋巴瘤细胞，使用龙胆紫染色，细胞计数观察效果。
7.本发明方法先进科学，通过本发明，提供的一种h3k9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大b淋巴瘤细胞增殖模型的构建方法，（1）通过在培养的淋巴瘤细胞中，加入h3k9甲基化酶抑制剂，使用龙胆紫染色，细胞计数观察效果。（2）在小鼠皮下注射步骤1）中h3k9甲基化酶抑制
剂处理以后的淋巴瘤细胞，24天后观察肿瘤大小。（3）rt
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qpcr检测步骤2）中的肿瘤组织中的肿瘤相关基因，验证h3k9me2甲基化酶抑制剂抑制淋巴瘤细胞增殖模型的建立。验证结果合理准确，实验过程严密周谨。
8.本发明的优越性在于：近年来研究发现，h3k9me2在肿瘤增殖过程密切相关，在肿瘤发生的过程中，通过调控h3k9me2的表达可以影响抑癌基因的表达，干扰肿瘤细胞增殖。本方法采用h3k9me2甲基化酶抑制剂来减低h3k9me2的表达，从而减低淋巴瘤细胞增殖的效率的方法，来建立h3k9me2甲基化酶抑制剂抑制淋巴瘤细胞增殖的模型，操作简单、结果准确，有利于指导h3k9me2甲基化酶抑制剂在淋巴瘤治疗中的应用。
附图说明
9.图1为淋巴瘤细胞经过h3k9甲基化酶抑制剂处理后龙胆紫染色，显微镜下细胞计数。
10.图2为小鼠皮下注射处理后的肿瘤细胞，3周后测量的肿瘤大小。
11.图3为 rt
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qpcr检测bcl
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2、bax和ki
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67蛋白基因。
具体实施方式
12.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
13.（1）选取淋巴瘤肿瘤细胞，采用细胞培养液进行体外培养；所述细胞培养液包括含10％胎牛血清的rpmi
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1640培养液；所述体外培养包括37℃二氧化碳培养箱中培养；（2）待肿瘤细胞生长至对数生长期后，将肿瘤细胞转移至4℃环境，使细胞生长同步化；（3）将步骤2)完成同步化生长的淋巴瘤细胞分成于2组，一组作为空白对照组，一组使用10mmol/l的h3k9甲基化酶抑制剂，放入37℃二氧化碳培养箱中培养；（4）24小时候，将步骤3)培养后的细胞更换无h3k9甲基化酶抑制剂的细胞培养液，继续放入37℃二氧化碳培养箱中培养；所述无h3k9甲基化酶抑制剂的细胞培养液包括含10％胎牛血清的rpmi
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1640培养液；（5）收集步骤4)得到细胞，龙胆紫染色，显微镜下计数细胞，评估增殖效率（图1），经过h3k9甲基化酶抑制剂处理后的细胞增殖速度减慢。
14.（6）收集步骤4)得到细胞，将1
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106个h3k9甲基化酶抑制剂处理以后的淋巴瘤细胞重悬于0.1 ml中pbs。然后将这种混合物注射到每只小鼠的右侧外侧胸。
15.（7）所有老鼠第于第24天处死小鼠,剥离瘤体,称量 (图2)。发现h3k9甲基化酶抑制剂处理后，肿瘤组织比未处理组明显减小。
16.（8）rt
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qpcr检测肿瘤相关基因bcl
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2、bax和ki
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67mrna水平：从组织中提取总rna，通过逆转录合成cdna。荧光定量pcr检测bcl
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2、bax和ki
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67的基因表达。pcr扩增反应体积包括2μlcdna、10μlsybr taq, 0.8μl上游和下游引物, 0.4μl roxii和pbs来弥补体积20μl。每个样本设置3个复孔，分析各孔扩增循环数( cycle threshold，ct )，mrna相对含量采用标化后的2－δδct 值表示，计算基因初始拷贝数的相对量。检测结果如附图3所示。可
见10mmol/l的h3k9甲基化酶抑制剂对于淋巴瘤增殖有抑制的作用。
17.从以上实施例可以看出，本发明建立h3k9me2甲基化酶抑制剂抑制淋巴瘤细胞增殖的模型，操作简单、结果准确，有利于指导h3k9me2抑制剂在淋巴瘤治疗中的应用。
18.相关器材，细胞培养箱，显微镜，载玻片，wb显色仪，trnzol，扩增引物，反转录试剂盒，荧光定量pcr仪。


技术特征：
1.一种h3k9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大b淋巴瘤细胞增殖模型的构建方法，其特征是，包括以下步骤：（1）、培养淋巴瘤细胞，培养淋巴瘤细胞的细胞培养液包括含10％胎牛血清的rpmi
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1640培养液，待淋巴瘤细胞生长至对数生长期后，向其中添加10mmol/l的h3k9甲基化酶抑制剂，放入37℃二氧化碳培养箱中培养；24小时后的淋巴瘤细胞更换无h3k9甲基化酶抑制剂的细胞培养液，继续放入37℃二氧化碳培养箱中培养；（2）、在小鼠皮下注射步骤（1）中h3k9甲基化酶抑制剂处理以后的淋巴瘤细胞，第24天处死小鼠，剥离瘤体，称重；（3）、收集步骤（2）小鼠肿瘤组织，rt
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qpcr检测肿瘤相关基因bcl
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2、bax和ki
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67的mrna表达量；验证h3k9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大b淋巴瘤细胞增殖模型的建立。2.一种h3k9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大b淋巴瘤细胞增殖模型的构建方法，其特征是，步骤（1）中，还包括：收集步骤（1）的培养的淋巴瘤细胞，使用龙胆紫染色，细胞计数观察效果。

技术总结
本发明涉及一种H3K9甲基化酶抑制剂抑制弥漫大B淋巴瘤细胞增殖模型的构建方法，通过在培养的淋巴瘤细胞中，加入H3K9甲基化酶抑制剂，使用龙胆紫染色，细胞计数观察效果。（2）在小鼠皮下注射步骤1）中H3K9甲基化酶抑制剂处理以后的淋巴瘤细胞，24天后观察肿瘤大小。（3）RT


技术研发人员：徐佩 孙小林 朱剑锋
受保护的技术使用者：泰州市人民医院
技术研发日：2021.08.26
技术公布日：2021/12/14