保幼激素类似物甲氧普林在促进蝙蝠蛾幼虫僵化中的应用的制作方法

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1.本发明属于冬虫夏草人工培育技术领域，具体涉及保幼激素类似物甲氧普林在促进蝙蝠蛾幼虫僵化中的应用。


背景技术：

2.冬虫夏草是由冬虫夏草菌ophiocordyceps sinensis侵染蝙蝠蛾幼虫形成的虫菌复合体，是青藏高原特有的名贵生物资源。随着消费者对冬虫夏草认可度的提升，消费量剧增，野生冬虫夏草的产量已经无法满足市场需求。经过数十载的研究，冬虫夏草的人工培育已取得了重大突破，包括冬虫夏草菌子实体的人工培育、寄主昆虫蝙蝠蛾低海拔规模化人工饲养以及利用冬虫夏草菌感染蝙蝠蛾幼虫获得媲美野生的冬虫夏草，极大地推动了高原生态环境和珍贵资源的保护和生物经济的发展。真菌的退化、宿主幼虫受病原菌的高死亡率、低而缓慢的感染僵化率等因素制约了冬虫夏草的高效生产，而影响僵化率(即芽生孢子转化为菌丝后形成的僵虫比例)高低的因素，关键在于冬虫夏草菌在寄主昆虫体内由芽生孢子转化为菌丝的效率。
3.真菌二态型是指一些真菌在环境因子的影响下，其菌体形态在酵母型与菌丝型发生相互转变的能力。冬虫夏草菌是典型的二态型真菌(芽生孢子-菌丝)，在特定因素的诱导下，可通过出芽生长产生更多的芽生孢子，或通过顶端生长形成细长的菌丝体(假菌丝)和菌丝。n-乙酰葡糖胺、脯氨酸、法尼醇、酪醇、甲基法尼酯、蜕皮激素可于体外不同程度地促进冬虫夏草菌芽生孢子转化为菌丝。但哪些化合物于蝙蝠蛾幼虫体内促进其僵化仍未确定。
4.昆虫蜕皮激素(20e)和保幼激素参与控制昆虫变态过程，还影响生殖、滞育等许多生理活性，是昆虫生长非常重要的调控因子，同时昆虫激素也是免疫系统的重要调节因子。保幼激素可同时抑制黄粉虫(tenebrio molitor)的酚氧化酶(po)和包埋作用，也可抑制埃及伊蚊aedes aegypti雌虫免疫相关基因(如抗菌肽等)。冬虫夏草菌进入蝙蝠蛾幼虫血腔后，昆虫激素也是其需要承受的胁迫压力之一。但是，同时注射保幼激素与真菌是否影响蝙蝠蛾幼虫的僵化鲜有报道。


技术实现要素：

5.基于上述问题，本发明的目的是提供保幼激素类似物甲氧普林在促进蝙蝠蛾幼虫僵化中的应用，从而解决注射感染蝙蝠蛾僵化比较耗时，人工培养冬虫夏草周期长的问题。
6.本发明通过实验发现，同时以冬虫夏草菌芽生孢子和保幼激素类似物甲氧普林注射感染蝙蝠蛾幼虫可促进被感染蝙蝠蛾幼虫的僵化。
7.因此，本发明可以将保幼激素类似物甲氧普林应用于促进被感染蝙蝠蛾幼虫的僵化。如可以在制备促进蝙蝠蛾幼虫僵化的制剂中应用。
8.本发明的第二个目的是提供一种促进蝙蝠蛾幼虫僵化的方法，其特征在于，同时以冬虫夏草菌芽生孢子和保幼激素类似物甲氧普林注射感染蝙蝠蛾幼虫，然后在培养过程
中促进被感染蝙蝠蛾幼虫的僵化。
9.所述的冬虫夏草菌芽生孢子是在冬虫夏草菌培养液中经过过滤获得的。芽生孢子的接种剂量为每头幼虫不高于107个。进一步优选，所述的芽生孢子的接种剂量为每头幼虫1.2
×
104个。
10.所述的保幼激素类似物甲氧普林，其接种到蝙蝠蛾幼虫体内的剂量为每头幼虫20μg。
11.所述的蝙蝠蛾幼虫龄期为6龄。
12.本发明针对被注射感染蝙蝠蛾幼虫僵化过程耗时，导致冬虫夏草人工培养周期长和效率低等问题，添加保幼激素类似物甲氧普林与冬虫夏草菌芽生孢子一起注射感染蝙蝠蛾幼虫，提高蝙蝠蛾幼虫的僵化率(61.85
±
3.37％)，显著高于仅注射芽生孢子(48.15
±
2.69％)幼虫的僵化率，说明同时注射冬虫夏草菌芽生孢子和甲氧普林可显著提高幼虫的僵化率。
附图说明：
13.图1是小金蝠蛾幼虫被注射kd、kd+20e、kd+m后于8-10℃120天的僵化率。柱子上面不同字母表示处理间在5％水平差异显著。
具体实施方式：
14.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
15.实施例1：
16.冬虫夏草菌株ophiocordyceps sinensis以组织分离法分离自四川康定的野生冬虫夏草(编号：kd)，经分子鉴定后-80℃保存。冬虫夏草菌液体培养基(pmg)：马铃薯200g煮汁，麦芽糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素b
1 0.02g，鲜大蜡螟幼虫5g研磨液，混合后以蒸馏水定容至1l，分装至250ml的三角瓶中，每瓶150ml，并于121℃高压灭菌30min，冷却后使用。于超净工作台上，将固体培养的冬虫夏草菌块(约0.5cm3)接种于上述液体培养基中，置于120rpm、9-13℃摇床上培养45天，收集芽生孢子。收集芽生孢子的方法：将液体培养液用3层无菌擦镜纸过滤，收集滤液至50ml已灭菌的离心管中，8000rpm、10℃离心15min，弃掉上清液，用无菌的磷酸盐缓冲液(pbs；ph＝7.0)重悬，再次离心弃掉上清液，将收集到的芽生孢子以无菌pbs稀释至6
×
106个/ml用于注射感染小金蝠蛾6龄幼虫。
17.小金蝠蛾幼虫通过人工饲养获得，6龄幼虫用于注射感染。
18.以35％dmso作为溶剂，将保幼激素类似物甲氧普林(methoprene,m)(sigma)配制成浓度为10ug/μl的溶液，经0.22μm细菌过滤器(millipore)过滤后使用。
19.利用显微注射仪(narishige,japan)将如下处理和对照：kd，注射芽生孢子，注射浓度3
×
106个/ml；kd+20e，注射芽生孢子与蜕皮激素的混合液，前者终浓度为3
×
106个/ml，后者浓度为5μg/μl；kd+m，注射芽生孢子与甲氧普林的混合液，前者终浓度为3
×
106个/ml，后者浓度为5μg/μl；20e，注射蜕皮激素，浓度为5μg/μl；m，注射甲氧普林，浓度为5μg/μl；h，未注射。分别注射至人工饲养的小金蝠蛾6龄幼虫中；每头幼虫的注射量为4μl。注射后的蝠蛾幼虫置于8-10℃房间培养；每个处理设置900头幼虫。
20.结果显示，20e、m、h组因为未注射芽生孢子，幼虫没有僵化。而注射kd、kd+20e、kd+
m的三个处理组的幼虫于90天开始出现僵化，120天时的僵化率超过40％(图1)。注射kd+m的幼虫僵化率(61.85
±
3.37％)显著高于注射kd(48.15
±
2.69％)和注射kd+20e(41.48
±
4.00％)幼虫的，说明同时注射冬虫夏草菌芽生孢子和甲氧普林可显著提高幼虫的僵化率。


技术特征：
1.甲氧普林在促进蝙蝠蛾幼虫僵化中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，甲氧普林在制备促进蝙蝠蛾幼虫僵化的制剂中应用。3.一种促进蝙蝠蛾幼虫僵化的方法，其特征在于，是在将冬虫夏草菌芽生孢子与甲氧普林一起感染蝙蝠蛾幼虫。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的冬虫夏草菌芽生孢子是在冬虫夏草菌培养液中经过过滤获得的。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的芽生孢子的接种剂量为每头幼虫不高于107个。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的芽生孢子的接种剂量为每头幼虫1.2
×
104个。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的甲氧普林，每头幼虫接种剂量为20μg。8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的蝙蝠蛾幼虫龄期为6龄。

技术总结
本发明公开了保幼激素类似物甲氧普林在促进蝙蝠蛾幼虫僵化中的应用。本发明针对被注射感染蝙蝠蛾幼虫僵化过程耗时，导致冬虫夏草人工培养周期长和效率低等问题，添加保幼激素类似物甲氧普林与冬虫夏草菌芽生孢子一起注射感染感染蝙蝠蛾幼虫，提高蝙蝠蛾幼虫的僵化率(61.85


技术研发人员：吴华 曹莉 熊佳福 周雯 韩日畴
受保护的技术使用者：力源新资源开发（广东）有限公司
技术研发日：2021.09.17
技术公布日：2022/2/6