1.本发明涉及实验动物模型构建领域，具体为一种tgf-β1构建小鼠乳腺纤维化模型的实验方法。
2.背景介绍
3.奶牛乳腺纤维化通常由久治不愈的乳腺炎迁延所致，不同的病原菌引起的临床型和隐型乳腺炎均可引起乳腺不同程度的纤维化。纤维化的乳腺导致产奶量明显下降，严重时无奶最终导致奶牛淘汰，给奶牛业造成巨大的经济损失。在乳腺炎症发展早期，成纤维细胞无明显病理变化，但到了急性炎症的后期，由于炎症对乳腺造成持续损伤使组织内稳态无法恢复，多种炎症细胞合成并释放细胞因子，这些细胞因子引起肌成纤维细胞的增生和活泌大量的细胞外基质(extracellularmatrix，ecm)，ecm的大量积累是所有纤维化病理过程的最主要致病因素，乳腺纤维化过程也同样如此。在研究中常常以collagen的蛋白水平来衡量ecm的积累程度，
4.有研究表明活化的肌成纤维细胞有三种来源，分别是50％来源于周围组织的迁移、35％来源于干细胞的分化、15％来源于上皮细胞间充质转化过程(epithelial mesenchymal transformation，emt)以上这些过程分都大量分泌ecm。其中在emt过程中上皮细胞逐渐失去极性并逐渐获得成纤维细胞的一些特性，具体包括α-sma蛋白和vimentin蛋白水平的升高，这意味着上皮细胞获得了较强的迁移和分泌能力；e-cadherin蛋白水平的显著降低，这意味着上皮细胞极性受到破坏和紧密连接蛋白水平降低，不利于乳腺屏障的完整性；collagen蛋白水平显著升高，代表着大量的ecm开始积累，纤维化进程已经开始。
5.在纤维化的过程中tgf-β1被大量分泌释放，其是促进纤维化病程发生发展的主要刺激因素，其也是促进肌成纤维细胞活化和emt继承的主要因素。在许多纤维化的研究中常常以tgf-β1诱导的体外模型为基础，筛选候选药物和疾病的深入机制。因此tgf-β1是各种器官中最有效的原发性纤维化诱导剂，并且更是在体外诱导细胞纤维化模型的黄金标准。
6.奶牛乳腺纤维化已经成为制约规模化奶牛养殖业发展的重要因素之一。然而，由于缺乏标准化实验动物模型，给奶牛乳腺纤维化相关疾病的防控、新型治疗药物和疫苗研发带来巨大的障碍。并且针对乳腺纤维化尚缺乏有效的病理损伤评价模型，血乳屏障的结构特殊性使乳腺纤维化的治疗方案不同于乳腺炎模型。因此，十分有必要构建一种易于操作和标准化的乳腺纤维化模型，为研发奶牛乳腺纤维化新型治疗方案奠定技术基础。因此本研究的目的是构建小鼠乳腺纤维化模型，以期望为临床奶牛乳腺纤维化疾病提供参考。
7.(一)解决的技术问题
8.根据目前关于缓解奶牛乳腺纤维化的不足之处，本发明构建了一种小鼠乳腺纤维化模型，以期望为临床奶牛乳腺纤维化疾病提供参考，有利于解决缓解奶牛乳腺纤维化过程中抗生素残留、耐药细菌的产生以及备选缓解药物不足等问题。
9.(二)技术方案
10.为达到上述要求，本专利提供以下实验步骤：一种构建小鼠乳腺纤维化模型的实验方法，具体操作如下：
11.s1、本实验选择8周龄的c57/bl6小鼠进行合笼，每笼1公2母，选取分娩后3至7天的c57/bl6小鼠作为实验对象。实验分为2组，分别是空白对照组(nt)、乳腺纤维化模型组(tgf-β1)，每组5只小鼠。
12.s2、在乳腺纤维化模型组中，用戊巴比妥钠将小鼠进行麻醉保定，每隔2天对小鼠的第四对乳区乳导管注射tgf-β1进行乳腺纤维化的模型构建，共4个周期，
13.s3、在注射tgf-β1 4个周期后进行乳腺的取样，一部分乳腺组织用于石蜡切片的制作，观察乳腺组织的病理损伤情况以及纤维化程度，通过组织免疫荧光观察α-sma蛋白水平的高低。取一部分乳腺组织用于pcr测定，通过il-6、il-1β、tnf-α、collagen 1、mmp1、mmp2、vimntin基因表达量的高低来反应炎性介质和细胞外基质的分泌情况，用来评估乳腺组织炎症和纤维化的严重程度。取一部分乳腺组织用于western blot测定，分析collagen 1、e-cadherin、vimentin、α-sma蛋白水平的高低，通过以上全部数据来判断乳腺纤维化模型构建是否成功。
14.优选的：小鼠乳腺纤维化模型构建方法为：每只小鼠按照45mg/kg的比例配制戊巴比妥钠溶液进行麻醉，仰面保定后，将第四对乳区周围进行消毒，剪掉约1mm乳头，两侧乳头均注射50μl浓度为100ng/ml的tgf-β1，共注射4次，周期为每隔2天注射一次，最后一次tgf-β1注射后24h后采取样品并放在-80℃冰箱保存。
15.优选的：石蜡切片的制作过程如下：取出新鲜的乳腺组织，用pbs涮洗后，放入4％的甲醛溶液中固定24h，经过不同浓度的酒精梯度脱水、放入二甲苯中透明、浸蜡、包埋、切片、h&e染色等步骤获取h&e染色结果，评估乳腺组织的病理损伤情况；通过masson染色操作说明书对乳腺组织石蜡切片进行masson染色，评估乳腺组织纤维化的损伤情况。
16.优选的：组织免疫荧光的制作过程如下：石蜡切片经过二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，0.1％triton
tm
×‑
100打孔，柠檬酸盐抗原修复，1％pbst封闭，经一抗和二抗孵育，dapi染色细胞核，封片，最后用荧光显微镜检测实验结果，通过组织免疫荧光观察α-sma表达量的高低。
17.优选的：pcr的实验步骤如下：在2ml培养皿中加入trizol试剂，置于室温使其充分裂解，提取总rna后进行反转录，在八连排管中加入反转录后的cdna 8μl，2
×
sybr premix 10μl，上下游引物各1μl，震荡摇匀后进行q-rtpcr。
18.优选的：western blot的实验步骤如下：将乳腺组织放入添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，研磨后4℃12000rpm离心10min收集上清。使用bca蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白转移到4％sds-page胶中，75v电泳30min，随后调节电压为110v下电泳60min。电泳后，蛋白质转移到pvdf膜上。用5％的脱脂牛奶封闭2h，一抗collagen 1、e-cadherin、vimentin、α-sma(1：1000)4℃孵育过夜,洗涤5次，山羊抗鼠或山羊抗兔二抗(1:8000)常温孵育1h，洗涤5次后检测蛋白条带，获取蛋白条带后分析以上全部数据判断小鼠乳腺纤维化模型构建是否成功。
19.(三)有益效果
20.1、该构建小鼠乳腺纤维化模型的实验方法，通过乳腺组织石蜡切片、h&e染色、masson染色的方法，从病理组织学的角度出发，证明了tgf-β1诱导的小鼠乳腺能够导致小鼠乳腺腺泡壁损伤、乳腺组织炎性细胞的浸润以及纤维化胶原沉积。证明了tgf-β1能够诱导小鼠乳腺乳腺病理组织的损伤和乳腺组织纤维化。
21.2、该构建小鼠乳腺纤维化模型的实验方法，通过pcr的实验方法，il-6、il-1β、tnf-α、collagen 1、mmp1、mmp2、vimentin基因的表达量显著升高，这表明tgf-β1诱导加重了鼠乳腺炎性介质浸润和乳腺纤维化。
22.3、该构建小鼠乳腺纤维化模型的实验方法，通过组织免疫荧光和westernblot的实验方法，tgf-β1诱导的小鼠乳腺能够导致小鼠乳腺组织collagen 1、vimentin、α-sma蛋白水平显著升高，e-cadherin蛋白水平显著降低，纤维化表型加重，通过以上数据表明tgf-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型构建成功。
附图说明
23.图1、为本专利中小鼠乳腺纤维化模型构建时间模式图；
24.图2、为本专利tgf-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型中对乳腺组织病理损伤影响以及纤维化损伤程度示意图；
25.图3、为本专利tgf-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型中pcr结果及mpo示意图；
26.图4、为本专利tgf-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型中对乳腺组织中免疫荧光及纤维化蛋白水平影响的示意图。
具体实施方式
27.结合本专利中所提供的数据，下面将对本发明实施例中的技术方案进行完整、准确的描述。本专业领域内的其他技术人员在没有做出突破性成果的前提下，所获得的其他实施例，均属于本发明的保护范畴。
28.s1、本实验选择8周龄的c57/bl6小鼠进行合笼，每笼1公2母，选取分娩后3至7天的c57/bl6小鼠作为实验对象。
29.s2、将小鼠分为两组，空白对照组(nt)，乳腺纤维化模型组(tgf-β1)，每组5只小鼠。
30.s3、在乳腺纤维化模型组中，用戊巴比妥钠将小鼠进行麻醉保定，每隔2天对小鼠的第四对乳区乳导管注射tgf-β1进行乳腺纤维化的模型构建，共4个周期，
31.s4、在注射tgf-β1第4个周期后进行乳腺的取样，用pbs涮洗后，放入4％的甲醛溶液中固定24h，经过不同浓度的酒精梯度脱水、放入二甲苯中透明、浸蜡、包埋、切片、h&e染色等步骤获取h&e染色结果，评估乳腺组织的病理损伤情况；通过masson染色操作说明书对乳腺组织石蜡切片进行masson染色，评估乳腺组织纤维化的损伤情况.
32.s5、石蜡切片经过二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，0.1％triton
tm
×‑
100打孔，柠檬酸盐抗原修复，1％pbst封闭，经一抗和二抗孵育，dapi染色细胞核，封片。最后用荧光显微镜检测实验结果，通过组织免疫荧光染色观察α-sma表达量的高低。
33.s6、在2ml培养皿中加入trizol试剂，置于室温使其充分裂解，提取总rna后进行反转录，在八连排管中加入反转录后的cdna 8μl，2
×
sybr premix 10μl，上下游引物各1μl，震荡摇匀后进行q-rtpcr。通过il-6、il-1β、tnf-α、collagen 1、mmp1、mmp2、vimentin基因表达量的高低来反应炎性介质和细胞外基质的分泌情况，用来评估乳腺组织炎症和纤维化的严重程度。
34.s7、取一部分乳腺组织用于westernblot测定。westernblot的实验步骤如下：将乳
腺组织放入添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，研磨后4℃12000rpm离心10min收集上清。使用bca蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白转移到4％sds-page胶中，75v电泳30min，随后调节电压为110v下电泳60min。电泳后，蛋白质转移到pvdf膜上。用5％的脱脂牛奶封闭2h，一抗collagen 1、e-cadherin、vimentin、α-sma(1：1000)4℃孵育过夜,洗涤5次，山羊抗鼠或山羊抗兔二抗(1:8000)常温孵育1h，洗涤5次后检测蛋白条带，获取蛋白条带后分析小鼠乳腺纤维化模型构建是否成功。
35.通过以上实验操作得到以下实验结果，统计分析如下：
36.图1为本专利中小鼠乳腺纤维化模型构建时间模式图；
37.由图2可以看出，nt组的乳腺腺泡轮廓清晰完整、腺泡之间的基质厚度正常、腺泡没有萎缩。而tgf-β1显著的促使乳腺腺泡萎缩、促使炎性细胞浸润，蓝色代表胶原纤维，其大量沉积，侵占了乳腺上皮细胞的空间、破坏了乳腺的正常结构、为纤维化病变的发生发展提供了发展环境。
38.由图3的结果我们可以得出，tgf-β1的注射显著引起乳腺组织内il-6、il-1β、tnf-α、collagen 1、mmp1、mmp2、vimentin基因表达量和mpo升高，这表明tgf-β1诱导的小鼠乳腺中炎性介质以及纤维化表型加重。
39.由图4的结果我们可以得出，tgf-β1显著的引起乳腺组织内collagen 1、vimentin、α-sma蛋白水平显著升高，e-cadherin蛋白水平显著降低(**p《0.01)，并且通过组织免疫荧光可以看出α-sma的表达量显著增多，表明tgf-β1模型组内发生了严重的纤维化反应。这表明tgf-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型构建成功。