一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，更具体地说，它涉及一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法。


背景技术：

2.大桥虎耳草(saxifraga daqiaoensis f.g.wang et f.w.xing)为虎耳草科，多年生草本植物，目前仅在广东韶关乳源大桥、秤架东坑深坑石灰岩岩壁发现2个居群，植株数量极少，处于濒危(en)状态为广东特有种。其对环境要求较高，生境特殊，生于海拔150-350m的石灰岩山地潮湿岩石上。植株高12-18cm。根状茎较短，茎无毛。基生叶无毛，盾状着生，肾形至圆形，革质，边缘疏被锯齿或近全缘，背面具紫褐色斑点。茎生叶少，披针状至卵状。花白色，花期3-5月。虎耳草植物具有较高的环境绿化价值，已经应用于小盆栽培，垂直绿化及林下地被产品。还具有较高的药用价值，有清热，凉血解毒，治风疹，湿疹，中耳炎，丹毒，咳嗽吐血，肺痈，崩漏，痔疾等功效。另外，还具有调控前列腺细胞的生长与细胞凋亡，保护肝脏、抗癌，抗氧化等作用。
3.虎耳草植物多采用播种和分株繁殖。其种子较小，通常很难采集到较多的种子，种子发芽率低。分株繁殖通常利用匍匐茎顶端的芽可以产出新的不定芽和不定根进行繁殖。而大桥虎耳草比较特殊，没有匍匐茎，自身分株繁殖数量少较慢。虎耳草植物组织培养繁殖的研究有少量报道。但大桥虎耳草的组培技术的研究的未见相关报道。
4.由于受到生态环境和人为破坏,大桥虎耳草野生植株目前较少，对其资源的保护和离体保存的研究具有重要的现实意义。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法，建立了大桥虎耳草离体培养再生体系，为物种的资源的保护，保存及繁殖利用提供有效的途径，为大桥虎耳草的遗传改良的研究奠定基础。
6.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
7.一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法，具体步骤如下：
8.s1、材料处理及表面消毒：采集并种植大桥虎耳草野生植株，取大桥虎耳草叶柄，去除叶片，将叶柄冲洗干净后，浸没在新洁尔灭溶液中搅拌，然后取出至酒精溶液中短暂浸泡，然后使用灭菌水多次清洗，随后将叶柄浸泡在氯化汞溶液中进行消毒；
9.s2、愈伤组织的诱导培养：将经过表面消毒的叶柄切成条状作为外植体，将外植体接种至诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，培养温度维持室温，暗培养诱导出愈伤组织；
10.s3、愈伤组织的分化培养：将叶柄诱导的愈伤组织切割后，接于分化培养基上进行分化培养，置于培养室内，培养温度维持室温，保持光照，光照时间为12h/d,诱导出不定芽；
11.s4、不定芽的增殖培养：将分化出的不定芽切分后转移到芽增殖培养基进行芽的增殖培养，置于培养室内，维持室温培养并维持光照，光照时间为12h/d；
12.s5、生根培养：将增殖的不定芽切分为单芽后转入生根培养基中，置于培养室，维持室温暗培养，诱导出根系；
13.s6、将带有根系的新芽种植，培养出新的大桥虎耳草植株。
14.在其中一个实施例中，所述诱导培养基，分化培养基，芽增殖培养基和生根培养基均含有改良ms培养基，所述改良ms培养基为nh4no3、kno3、mgso4·
7h2o和kh2po4含量减半，cacl2·
2h2o含量不变的ms培养基。
15.在其中一个实施例中，在步骤s2中，所述诱导培养基的组分及含量为：改良ms培养基、1～4mg/l的6-ba、0.2～1mg/l的naa、2g/l的pvp、30g/l蔗糖和6～7g/l琼脂粉；或改良ms培养基、1～2mg/l的kt、0.2～0.5mg/l的naa、2g/l的pvp、30g/l蔗糖和琼脂粉6～7g/l；或改良ms培养基、0.1～0.2mg/l的tdz、0.2～0.5mg/l的naa、2g/l的pvp、30g/l的蔗糖和6～7g/l的琼脂粉。
16.在其中一个实施例中，在步骤s3中，所述分化培养基的组分及含量为：改良ms培养基、1～4mg/l的6-ba、0.1～0.2mg/l的naa、2g/l的pvp、30g/l蔗糖和6～7g/l的琼脂粉。
17.在其中一个实施例中，步骤s4中，将分化出的不定芽切分后，每组含有2～3芽，转移到芽增殖培养基。
18.在其中一个实施例中，所述芽增殖培养基的组分及含量为：改良ms培养基、2～3mg/l的6-ba、0.2mg/l的naa、30mg/l的蔗糖和6～7g/l的琼脂；或改良ms培养基、0.2～0.3mg/l的tdz、0.2mg/l的naa、30g/l的蔗糖和6～7g/l的琼脂粉。
19.在其中一个实施例中，在步骤s5中，所述生根培养基的组分及含量为：改良ms培养基、0.2～0.5mg/l的naa、30g/l的蔗糖和6～7g/l的琼脂粉；或ms、0.2～0.5mg/l的iba、30g/l的蔗糖和6～7g/l的琼脂粉。
20.在其中一个实施例中，所述诱导培养基，分化培养基，芽增殖培养基和生根培养基的ph值均为5.8～6.0。
21.在其中一个实施例中，在步骤s2中，将经过表面消毒的叶柄切成长度在1-1.5cm长条状作为外植体，而且将外植体平放接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养。
22.在其中一个实施例中，在步骤s3和步骤s4中，光照强度均为1500-2000lx。
23.综上所述，本发明具有以下有益效果：
24.本发明以大桥虎耳草叶柄作为外植体，配置添加了细胞分裂素6-ba，kt和tdz与生长素naa组合的诱导培养基，诱导愈伤组织，诱导率达80％以上，可不伤害或少伤害母株，适用于野生材料稀少的种质的繁殖利用，还可应用于大桥虎耳草的遗传转化研究；本发明的分化培养中，愈伤组织的不定芽分化率在80％以上，大大提高了不定芽分化的数量，在不定芽增殖的培养中，不定芽的增殖率达到80％以上。在某种程度上决定了愈伤组织再生植株的效率，试管苗生根率可达100％，植株生长健壮，根系发达，为其后期的遗传转化研究奠定了基础。
附图说明
25.图1中，a：野外取材移栽到大棚的大桥虎耳草开花；b：叶柄诱导出愈伤组织；c：愈伤组织分化出不定芽；d：不定芽增殖出较多芽；e：根系的生长状态；f：生根的植株。
具体实施方式
26.下面结合实施例，对本发明进行详细描述。
27.目前由于受到生态环境恶化和人为破坏,大桥虎耳草野生植株已濒临灭绝，大桥虎耳草主要依靠种子繁殖的方式进行繁育，其繁殖数量少，繁殖速度慢，被认为是导致其稀少的原因之一。因此，对大桥虎耳草的保护和人工繁育的研究具有重要的现实意义。本发明通过组培快繁的方式,可能达到人工繁育大桥虎耳草的目的，其可以不受季节的限制，有可能在较短时间内获得大量大桥虎耳草植株,为该物种的种质资源的保存，繁殖，市场化提供有效的途径。
28.在现有技术中未见大桥虎耳草的组织培养的相关报道。大桥虎耳草有其自身的独特性，相比于其他种的虎耳草植物，大桥虎耳草缺少匍匐茎，只有根状茎，因此现有技术中无法对大桥虎耳草进行分株繁殖，在野外可观察到大桥虎耳草目前主要是通过种子传播的方式进行繁殖，但是其种子存活率低，难以人工繁殖。
29.如图1所示，本发明提供一种利用大桥虎耳草叶柄获得再生植株的方法，包括外植体表面消毒，诱导愈伤组织，愈伤组织分化不定芽，不定芽增殖和不定芽生根。不定芽增殖良好，增殖系数可达4倍以上，不定芽生根良好，生根条数可达5-10条。培育的大桥虎耳草植株与母株性状一致；具体培养步骤如下：
30.s1、材料的处理和表面消毒：
31.采集大桥虎耳草野生植株，种植在温室大棚里。待其适应生长后，取大桥虎耳草叶柄，去掉叶片，将叶柄用洗洁净洗干净表面的灰尘后，在流水下冲洗1h，后用0.3％的新洁尔灭在磁力搅拌器上搅拌30min，在75％酒精中浸泡30s，灭菌水清洗3次，hgcl2浸泡消毒时间8～10min，灭菌水清洗4次。
32.s2、愈伤组织的诱导培养：
33.将经过表面消毒的叶柄，切成长约1cm作为外植体，平放接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，置于培养室内，培养温度(25
±
1)℃，暗培养30-40天，诱导出愈伤组织；
34.其中，诱导培养基包含改良ms培养基，所述改良ms培养基包含nh4no3、kno3、mgso4·
7h2o和kh2po4含量减半，cacl2·
2h2o含量不变的ms培养基；
35.其中，诱导培养基的具体成分及含量：改良ms培养基+1～4mg/l的6-ba+0.2～1mg/l的naa+2g/l的pvp+30g/l蔗糖+6～7g/l的琼脂粉；或改良ms培养基+1～2mg/l的kt+0.2～0.5mg/l的naa+2g/l的pvp+30g/l的蔗糖+6～7g/l的琼脂粉；或改良ms培养基+0.1～0.2mg/l的tdz+0.2～0.5mg/l的naa+2g/l的pvp+30g/l的蔗糖+6～7g/l琼脂粉，诱导培养基的ph为5.8～6.0。
36.本发明对大桥虎耳草的叶柄进行诱导培养，在ms培养基中添加配合细胞分裂素6-ba，kt和tdz与生长素naa组合，20d后叶柄切口开始膨大，有少量微小愈伤组织形成，继续培养至30d，愈伤组织诱导率更高，达80％以上。
37.s3、愈伤组织的分化培养：
38.将叶柄诱导的愈伤组织切割后，接于愈伤组织分化培养基上进行分化培养，置于培养室内，培养温度(25
±
1)℃、光照1500-2000lx、光照时间12h/d。培养30-40天，诱导出不定芽；
39.其中，叶柄诱导的愈伤组织切割后，接于愈伤组织分化培养基上，分化培养基的组
分及其含量为：改良ms培养基+1～4mg/l的6-ba+0.1～0.2mg/l的naa+2g/l的pvp+30g/l的蔗糖+6～7g/l的琼脂粉，分化培养基的ph为5.8～6.0；
40.在愈伤组织的分化培养中，合适的6-ba浓度下，不定芽分化率达80％以上，且芽生长良好，芽多，出现玻璃化现象较少。
41.s4、不定芽的增殖培养：
42.将分化出的不定芽切分后，转移到芽增殖培养基进行芽的增殖培养，置于培养室内，培养温度(25
±
1)℃、光照1500-2000lx、光照时间12h/d；
43.其中，将分化出的不定芽切分后，每组含有2-3芽，转移到芽增殖培养基，芽增殖培养基的组份及其含量为：改良ms培养基+2～3mg/l的6-ba+0.2mg/l的naa+30mg/l的蔗糖+6～7g/l的琼脂；或改良ms培养基+0.2～0.3mg/l的tdz+0.2mg/l的naa+30g/l的蔗糖+6～7g/l的琼脂粉，芽增殖培养基的ph为5.8～6.0；在不定芽增殖的培养中，合适的tdz和6-ba浓度，不定芽的增殖率达到80％以上。
44.s5、生根培养：
45.将增殖的不定芽切分成单芽后转入生根培养基，置于培养室，培养温度(25
±
1)℃，暗培养30-40天，诱导出根系。
46.其中，将增殖的不定芽切分成单芽后转入生根培养基上，生根培养基的组份及其含量为：改良ms培养+0.2～0.5mg/l的naa+30g/l的蔗糖+6～7g/l的琼脂粉；或改良ms培养+0.2～0.5mg/l的iba+30g/l的蔗糖+6～7g/l的琼脂粉，生根培养基的ph为5.8～6.0。
47.s6、将带有根系的新芽种植，培养出新的大桥虎耳草植株。
48.本发明选用了合适的再生外植体，以叶柄作为外植体，配置添加了细胞分裂素6-ba，kt和tdz与生长素naa组合的诱导培养基，诱导愈伤组织，诱导率达80％以上，可不伤害或少伤害母株，适用于野生材料稀少的种质的繁殖利用，还可应用于大桥虎耳草的遗传转化研究。
49.本发明的分化培养中，愈伤组织的不定芽分化率在80％以上，大大提高了不定芽分化的数量，在不定芽增殖的培养中，不定芽的增殖率达到80％以上。在某种程度上决定了愈伤组织再生植株的效率，试管苗生根率可达100％，植株生长健壮，根系发达，为其后期的遗传转化研究奠定了基础。
50.本发明应用组织培养技术建立有效的大桥虎耳草人工快繁体系，以大桥虎耳草叶柄为外植体，以ms为基本培养基，通过不同激素种类和浓度配比选择出了适宜的愈伤组织诱导、分化、芽增殖和生根培养基配方，为工厂化生产大桥虎耳草种苗，提供理论基础和实践操作技术。
51.以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。