口腔上皮细胞条件性敲除SLC1A5基因小鼠模型及其构建方法

本发明属于医学动物模型，具体涉及口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型及其构建方法。

背景技术：

1、asct2(slc1a5)介导的谷氨酰胺代谢在中间代谢、组织器官间氮的交换以及机体ph稳态等方面发挥重要作用。谷氨酰胺(gln)一方面可在线粒体内被谷氨酰胺酶(gls)水解成谷氨酸，进而在谷氨酸脱氢酶或转氨酶催化下生成α-酮戊二酸和氨(nh3)，α-酮戊二酸进入柠檬酸循环，为线粒体氧化磷酸化提供碳源，保障肿瘤细胞的能量供应。另一方面可为肿瘤细胞葡萄糖、蛋白质、核苷酸及脂质等的合成提供碳源和氮源。此外，谷氨酰胺可促进谷胱甘肽(gsh)及nadph的合成，增强细胞的抗氧化能力。亦有研究显示谷氨酰胺代谢可激活m-torc1信号通路、参与上皮间充质转化以及影响表观遗传。研究表明，asct2在口腔癌在内的多种口腔疾病中高表达，且与患者不良预后相关。且已有部分研究显示靶向敲减asct2的表达可抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖并促进其凋亡。尽管近年来对于asct2在口腔鳞状细胞癌乃至头颈部鳞状细胞癌中作用和相关机制有了部分进展，然而相应的探索多借助体外shrna(基因工程手段)，asct2抑制剂(gpna等)或体内异种移植瘤模型进行，缺乏更具说服力的体内研究模型以进一步探究具体信号通路。

2、由于复杂的机体内环境，体外研究手段往往不足以充分探究asct2在口腔癌乃至头颈鳞癌中的作用和相关机制。异种移植瘤模型的肿瘤细胞因连续传代适应培养环境，丧失了肿瘤微环境，且宿主小鼠为t细胞免疫缺陷的裸鼠，缺少与免疫细胞的交互作用。而基因的全身敲除或敲入的传统转基因模型往往缺乏组织特异性和细胞特异性，不能特异性研究asct2在口腔中的作用。此外，基因的全身敲除或敲入可能影响小鼠的胚胎发育，导致小鼠胎死，不利于后续疾病模型的构建与机制探讨。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型及其构建方法，为探究slc1a5在口腔癌等口腔疾病中的作用和相关机制，为口腔癌的靶向治疗提供新的视角

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：

3、(1)将slc1a5tm1.1cyagen纯合子flox小鼠净化后获得杂合子slc1a5 fl/-小鼠；

4、(2)将杂合子slc1a5 fl/-小鼠与c57bl/6野生型小鼠交配，获得slc1a5 fl/fl纯合子小鼠；

5、(3)将slc1a5 fl/fl纯合子小鼠与krt14-cre ertam小鼠交配获得slc1a5 fl/-cre+/-小鼠；

6、(4)将slc1a5 fl/-cre+/-小鼠和slc1a5 fl/fl小鼠交配，获得slc1a5 fl/fl cre+/-小鼠；

7、(5)采用诱导剂诱导slc1a5 fl/fl cre+/-小鼠，得所述口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型。

8、本发明的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法中krt14-creertam/slc1a5tm1.1cyagen转基因敲除小鼠可以使目标基因(slc1a5)实现时空特异性表达。角蛋白krt14主要在复层鳞状上皮基底层和毛囊基质的角质细胞中表达，而krt14-cre ertam序列可使表达krt14的细胞同时表达cre酶(空间特异性)。当给小鼠腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen)后，角质细胞中cre酶进入细胞核特异性识别两个lox序列，并剪切掉他们中间拟敲除的slc1a5基因序列，使slc1a5在角质细胞中停止表达(时间特异性)，从而实现slc1a5的时空特异性敲除，即只在注射他莫昔芬后才能在角质细胞中敲除slc1a5。

9、作为本发明所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述诱导剂为他莫昔芬。

10、作为本发明所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述他莫昔芬的使用剂量为75mg/kg。

11、作为本发明所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(1)、步骤(3)和步骤(5)包括对获得的小鼠进行基因型鉴定。

12、作为本发明所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(1)对获得的小鼠进行基因型鉴定的引物的核苷酸序列如seq idno.1和seq id no.2所示。

13、作为本发明所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(3)对获得的小鼠进行基因型鉴定的引物的核苷酸序列如seq idno.3和seq id no.4所示。

14、作为本发明所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤(5)对获得的小鼠进行基因型鉴定的引物的核苷酸序列如seq idno.5和seq id no.6所示。

15、本发明还提供一种口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型，采用所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法制备得到。

16、本发明还提供所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型在口腔疾病研究中的应用。

17、本发明的有益效果：本发明提供口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型及其构建方法，本发明的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型既克服了常规体外研究手段未考虑复杂机体内环境的影响，也克服了异种移植瘤模型的肿瘤细胞因连续传代丧失肿瘤微环境和缺乏免疫细胞相互作用的缺陷；本发明的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型避免了slc1a5的全身敲除可能导致的小鼠胚胎发育不良等问题；本发明的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型为探究slc1a5在口腔癌等口腔疾病中的作用和相关机制，为口腔癌的靶向治疗提供新的视角。

技术特征：

1.一种口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述诱导剂为他莫昔芬。

3.根据权利要求2所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述他莫昔芬的使用剂量为75mg/kg。

4.根据权利要求1所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)、步骤(3)和步骤(5)包括对获得的小鼠进行基因型鉴定。

5.根据权利要求4所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)对获得的小鼠进行基因型鉴定的引物的核苷酸序列如seq idno.1和seq id no.2所示。

6.根据权利要求4所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)对获得的小鼠进行基因型鉴定的引物的核苷酸序列如seq idno.3和seq id no.4所示。

7.根据权利要求4所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)对获得的小鼠进行基因型鉴定的引物的核苷酸序列如seq idno.5和seq id no.6所示。

8.一种口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型，其特征在于，采用权利要求1～7任一项所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型的构建方法制备得到。

9.根据权利要求8所述的口腔上皮细胞条件性敲除slc1a5基因小鼠模型在口腔疾病研究中的应用。

技术总结
本发明公开了口腔上皮细胞条件性敲除SLC1A5基因小鼠模型及其构建方法，属于医学动物模型技术领域。本发明的口腔上皮细胞条件性敲除SLC1A5基因小鼠模型的构建方法。本发明的口腔上皮细胞条件性敲除SLC1A5基因小鼠模型既克服了常规体外研究手段未考虑复杂机体内环境的影响，也克服了异种移植瘤模型的肿瘤细胞因连续传代丧失肿瘤微环境和缺乏免疫细胞相互作用的缺陷，同时也避免了SLC1A5的全身敲除可能导致的小鼠胚胎发育不良等问题，为探究SLC1A5在口腔癌等口腔疾病中的作用和相关机制，为口腔癌的靶向治疗提供新的视角。

技术研发人员：陶小安,程斌,李围,夏娟,凌子航,吴桐
受保护的技术使用者：中山大学附属口腔医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13