一种转基因青蒿以及提高青蒿中青蒿素含量的方法

本发明涉及一种转基因青蒿以及提高青蒿中青蒿素含量的方法，涉及转基因。

背景技术：

1、青蒿素是一种含有过氧桥键的倍半萜内酯化合物，对疟原虫具有较强的杀灭作用，是治疗效果最好的抗疟疾药物。青蒿素在青蒿中的含量低，仅占叶片干重的0.1-1％。青蒿是青蒿素的主要来源，提高青蒿中青蒿素的含量具有重要的应用价值和实际意义。通过杂交育种、控制生长环境等方式有助于提高青蒿中青蒿素的含量，但提高效果有限。通过基因工程技术提高青蒿腺毛密度以及提高控制青蒿素合成关键酶的基因的表达，是提高青蒿中青蒿素含量的有效手段。

2、如何确定合适的基因从而提高青蒿腺毛密度以及青蒿素含量，是本领域技术人员持续关注的问题。

技术实现思路

1、本发明提供一种转基因青蒿以及提高青蒿中青蒿素含量的方法，用于提高青蒿腺毛密度以及青蒿素含量。

2、本发明第一方面提供一种转基因青蒿，所述转基因青蒿能够表达ads、cyp71av1、dbr2、aldh1、msgsw2基因，其中：

3、所述ads具有如seq id no.1所示的核酸序列；

4、所述cyp71av1具有如seq id no.2所示的核酸序列；

5、所述dbr2具有如seq id no.3所示的核酸序列；

6、所述aldh1具有如seq id no.4所示的核酸序列；

7、所述msgsw2具有如seq id no.6所示的核酸序列。

8、进一步地，基于每平方毫米的转基因青蒿叶片，腺毛密度大于等于32个/mm2。

9、进一步地，基于每片转基因青蒿叶片的干重，青蒿素的含量为16.4-24.7mg/g。

10、本发明第二方面提供一种提高青蒿中青蒿素的方法，所述方法包括：使青蒿表达ads、cyp71av1、dbr2、aldh1、msgsw2基因。

11、进一步地，使青蒿表达ads、cyp71av1、dbr2、aldh1、msgsw2基因，具体包括如下步骤：

12、构建包括所述ads、cyp71av1、aldh1、dbr2、msgsw2、hptii、bar基因的重组载体，所述hptii具有如seq id no.5所示的核酸序列，所述bar具有如seq id no.7所示的核酸序列；

13、构建包括所述重组载体的重组转化体；

14、将所述重组转化体转入青蒿中，筛选得到能够表达所述基因的青蒿植株。

15、进一步地，使青蒿表达ads、cyp71av1、dbr2、aldh1、hptii、msgsw2、bar基因，具体包括如下步骤：

16、构建包括所述ads、cyp71av1、aldh1、dbr2、msgsw2、hptii、bar基因的重组载体；

17、构建包括所述重组载体的重组转化体；

18、将所述重组转化体转入青蒿中，筛选得到能够表达所述基因的青蒿植株。

19、进一步地，构建包括所述ads、cyp71av1、aldh1、dbr2、msgsw2、hptii、bar基因的重组载体具体包括如下步骤：

20、分别以所述ads、cyp71av1、aldh1、dbr2、msgsw2、hptii、bar基因为模板，在其上游和下游分别连接引物，得到基因扩增片段；所述引物分别具有seq id no.21-34所示的核苷酸序列；

21、将所述ads、cyp71av1、aldh1、dbr2、msgsw2、hptii、bar的基因扩增片段与pupd2质粒进行边切边连，获得pupd2-ads-2a-cyp71av1、pupd2-dbr2-2a-aldh1、pupd2-msgsw2、pupd2-hptii、pupd2-bar五个一级载体；

22、将pupd2-msgsw2、pupd2-ads-2a-cyp71av1两个一级载体分别与启动子和终止子组合并构建至pdgb3_alpha1载体质粒上，将pupd2-dbr2-2a-aldh1、pupd2-hptii、pupd2-bar三个一级载体分别与启动子和终止子组合并构建至pdgb3_alpha2载体质粒上，获得α1-msgsw2、α1-ads-2a-cyp71av1、α2-dbr2-2a-aldh1、α2-hptii、α2-bar五个二级载体；

23、将α1-ads-2a-cyp71av1与α2-dbr2-2a-aldh1组合并构建至pdgb3_omega1载体质粒上，将α1-msgsw2、α2-hptii组合并构建至pdgb3_omega2载体质粒上，获得ω1-ads-2a-cyp71av1-dbr2-2a-aldh1和ω2-msgsw2-hptii两个三级载体；

24、将ω1-ads-2a-cyp71av1-dbr2-2a-aldh1和ω2-msgsw2-hptii两个三级载体组合并构建至pdgb3_alpha1载体质粒上，得到α1-ads-2a-cyp71av1-dbr2-2a-aldh1-msgsw2-hptii四级载体；

25、将所述α1-ads-2a-cyp71av1-dbr2-2a-aldh1-msgsw2-hptii四级载体与α2-bar二级载体组合并构建至pdgb3_omega2载体质粒上，得到所述重组载体。

26、进一步地，所述重组载体还包括tpact启动子，所述tpact启动子具有如seq idno.8所示的核酸序列。

27、进一步地，所述方法还包括：以tpact启动子为模板，在其上游和下游分别连接引物，得到启动子扩增片段；将所述tpact启动子分别与pupd2-ads-2a-cyp71av1、pupd2-dbr2-2a-aldh1两个一级载体连接，得到α1-ads-2a-cyp71av1以及α2-dbr2-2a-aldh1两个二级载体。

28、进一步地，所述重组转化体为包括所述重组载体的根癌农杆菌。

29、进一步地，采用冻融法将所述重组载体导入所述根癌农杆菌中。

30、本方面通过多基因组装技术，获得了转基因青蒿，能够有效提高青蒿腺毛密度以及青蒿素含量，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。

技术特征：

1.一种转基因青蒿，其特征在于，所述转基因青蒿能够表达ads、cyp71av1、dbr2、aldh1、msgsw2基因，其中：

2.根据权利要求1所述的转基因青蒿，其特征在于，基于每平方毫米的转基因青蒿叶片，腺毛密度大于等于32个/mm2。

3.根据权利要求1或2所述的转基因青蒿，其特征在于，基于每片转基因青蒿叶片的干重，青蒿素的含量为16.4-24.7mg/g。

4.一种提高青蒿中青蒿素的方法，其特征在于，所述方法包括：使青蒿表达ads、cyp71av1、dbr2、aldh1、msgsw2基因。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使青蒿表达ads、cyp71av1、dbr2、aldh1、msgsw2基因，具体包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，构建包括所述ads、cyp71av1、aldh1、dbr2、msgsw2、hptii、bar基因的重组载体具体包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组载体还包括tpact启动子，所述tpact启动子具有如seq id no.8所示的核酸序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：以tpact启动子为模板，在其上游和下游分别连接引物，得到启动子扩增片段；将所述tpact启动子分别与pupd2-ads-2a-cyp71av1、pupd2-dbr2-2a-aldh1两个一级载体连接，得到α1-ads-2a-cyp71av1以及α2-dbr2-2a-aldh1两个二级载体。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组转化体为包括所述重组载体的根癌农杆菌。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，采用冻融法将所述重组载体导入所述根癌农杆菌中。

技术总结
本发明提供一种转基因青蒿以及提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明第一方面提供一种转基因青蒿，所述转基因青蒿能够表达ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1、MsGSW2基因，所述ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1、MsGSW2基因分别具有如SEQ ID NO.1‑4、6所示的核苷酸序列。本发明通过多基因组装技术，获得了转基因青蒿，能够有效提高青蒿腺毛密度以及青蒿素含量，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。

技术研发人员：唐克轩,李勇鹏,严欣,彭柏文,付雪晴,孙小芬,秦维
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13