培养基、萝卜游离小孢子的培养方法及OguraCMS类型保持系的创制方法与流程

本申请涉及植物育种，具体涉及一种培养基、萝卜游离小孢子的培养方法及ogura cms类型保持系的创制方法。

背景技术：

1、萝卜(raphanussativus l.)为十字花科萝卜属，属于二年或一生作物，在我国蔬菜作物中占据重要地位，具有营养丰富、药用食疗价值高的特点，深受人们喜爱。我国是世界上萝卜生产第一大国，2020年萝卜的播种面积达到1950万亩，占蔬菜总播种面积的5.6％左右，2020年萝卜的产量约为4500万吨。

2、萝卜为典型的异花授粉植物，自交衰退严重，且杂种优势明显，市售萝卜品种多以杂交种为主。自交不亲和系(self-incompatibility,si)制种法和雄性不育系(cytoplasmic male sterility,cms)制种法是当前常规的两种萝卜育种手段，其中，自交不亲和系制种法容易受环境因素的干扰，从而对杂交种的纯度造成负面影响，相较于自交不亲和系制种，雄性不育系制种具有杂种一代纯度高、制种成本低、技术简单、亲本不易流失等优点。对于雄性不育系制种来说，优良保持系的选育是影响制种的关键因素，而优良的天然保持系较少，选育纯合、稳定的优良保持系同样需要经过多年大量的测交工作，即常规保持系的创制需要经历5～6个世代的定向转育，具有育种年限较长和育种效率较低的缺点。

3、游离小孢子培养是在花药培养基础上发展起来的一项新兴技术，小孢子具有单倍性，通过单倍体的染色体加倍即可获得纯合的双倍体，利用游离小孢子培养技术获得纯合体仅需1～2年，从而缩短育种年限和提高育种效率。然而，在十字花科作物中，萝卜是最难成功培养出小孢子的作物之一，目前，对萝卜进行游离小孢子培养的出胚率很低。游离小孢子培养的培养基组分是影响萝卜小孢子出胚率的关键因素，因此，如何优化游离小孢子培养所采用的培养基以提高萝卜小孢子的出胚率对萝卜育种具有重要意义。

技术实现思路

1、第一方面，本申请提供了一种培养基，以提高萝卜小孢子的出胚率。所述培养基为包含80g/l至150g/l的蔗糖、0g/l至0.4g/l的活性碳以及0.1mg/l至1.0g/l的生长调节剂的1/2nln培养基；其中，所述生长调节剂选自吗啉乙磺酸、两性霉素b、褪黑素、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、吲哚乙酸、激动素、丁酸钠或硝酸银中的至少一种。

2、可选地，生长调节剂选自褪黑素和萘乙酸的组合物；在所述培养基中，所述褪黑素的浓度为0.1mg/l至0.3mg/l，所述萘乙酸的浓度为0.8mg/l至1mg/l。

3、可选地，生长调节剂选自吗啉乙磺酸和两性霉素b的组合物；在所述培养基中，所述吗啉乙磺酸的浓度为0.6g/l至0.8g/l，所述两性霉素b的浓度为0.005mg/l至0.03mg/l。

4、可选地，所述生长调节剂选自丁酸钠和硝酸银的组合物；在所述培养基中，所述丁酸钠的浓度为0.2mg/l至0.3mg/l，所述硝酸银的浓度为0.1mg/l至0.3mg/l。

5、可选地，所述生长调节剂选自萘乙酸和丁酸钠的组合物；在所述培养基中，所述萘乙酸的浓度为0.1mg/l至1mg/l，所述丁酸钠的浓度为0.2mg/l至0.3mg/l。

6、可选地，所述生长调节剂选自6-苄氨基嘌呤和吲哚乙酸的组合物；在所述培养基中，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为0.2mg/l至0.4mg/l，所述吲哚乙酸的浓度为0.3mg/l至0.5mg/l。

7、可选地，所述生长调节剂选自萘乙酸和激动素的组合物；在所述培养基中，所述萘乙酸的浓度为0.05mg/l至1mg/l，所述激动素的浓度为0.05mg/l至0.5mg/l。

8、可选地，所述生长调节剂选自激动素和吲哚乙酸的组合物；在所述培养基中，所述激动素的浓度为0.1mg/l至0.4mg/l，所述吲哚乙酸的浓度为0.1mg/l至0.8mg/l。

9、本申请还提供了一种萝卜游离小孢子的培养方法，包括步骤：采用第一方面中任意一种所述的培养基培养萝卜小孢子以形成胚状体，以提高萝卜小孢子的出胚率，从而提高萝卜游离小孢子培养的成功率。

10、可选地，萝卜游离小孢子的培养方法还包括步骤：

11、对所述胚状体进行分化培养，获得小孢子植株；

12、对所述小孢子植株进行继代培养，获得继代植株；

13、对所述继代植株进行复壮培养，获得无根幼苗；以及

14、对所述无根幼苗进行生根培养，获得小孢子试管苗。

15、可选地，所述分化培养所采用的培养基为包含浓度为20mg/l至80mg/l的头孢噻胯、80g/l至150g/l的蔗糖、0.05mg/l至0.2mg/l的6-苄氨基嘌呤以及0.2mg/l至1mg/l的萘乙酸的b5培养基。

16、本申请还提供了一种萝卜ogura cms类型保持系的创制方法，以缩短育种年限和提高育种效率，所述创制方法包括步骤：

17、采用如第一方面中任意一种所述的培养基培养萝卜小孢子以形成胚状体，并将所述胚状体培养形成可在自然环境生长的试验植株；

18、待所述试验植株开花后，对所述试验植株进行自交授粉，获得dh系植株；以及

19、采用高通量kasp分子标记筛选所述dh系植株，获得rfo基因的基因型为rfrf的植株，性状优良且rfo基因的基因型为rfrf的植株为萝卜ogura cms类型保持系。

20、本申请提供了一种培养基、萝卜游离小孢子的培养方法及ogura cms类型保持系的创制方法，具有如下技术效果：

21、本申请的培养基包含蔗糖、活性碳和生长调节剂，生长调节剂选自吗啉乙磺酸、两性霉素b、褪黑素、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、吲哚乙酸、激动素、丁酸钠或硝酸银中的至少一种，采用所述培养基培养萝卜游离小孢子可有效提高成胚率。

22、本申请的萝卜游离小孢子的培养方法包括步骤：采用所述培养基培养萝卜小孢子以形成胚状体，能够有效提升萝卜小孢子的出胚率，降低萝卜游离小孢子培养的难度，提高萝卜游离小孢子培养的成功率。

23、在本申请的ogura cms类型保持系的创制方法中，先采用所述培养基培养萝卜小孢子以形成胚状体，并将胚状体培养形成可在自然环境生长的试验植株，待试验植株开花后，对试验植株进行自交授粉以获得dh系植株，再采用高通量kasp分子标记筛选获得rfo基因的基因型为rfrf的植株以作为萝卜ogura cms类型保持系，仅需1～2年即可选育获得纯合、稳定的优良萝卜ogura cms类型保持系，相较于传统萝卜ogura cms类型保持系的创制方法，极大地缩短了育种年限，有效地提升了育种效率。

技术特征：

1.一种培养基，其特征在于，所述培养基为包含80g/l至150g/l的蔗糖、0g/l至0.4g/l的活性碳以及0.1mg/l至1.0g/l的生长调节剂的1/2nln培养基；

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述生长调节剂选自褪黑素和萘乙酸的组合物；

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述生长调节剂选自吗啉乙磺酸和两性霉素b的组合物；

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述生长调节剂选自丁酸钠和硝酸银的组合物，在所述培养基中，所述丁酸钠的浓度为0.2mg/l至0.3mg/l，所述硝酸银的浓度为0.1mg/l至0.3mg/l；

5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述生长调节剂选自6-苄氨基嘌呤和吲哚乙酸的组合物；

6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述生长调节剂选自萘乙酸和激动素的组合物，在所述培养基中，所述萘乙酸的浓度为0.05mg/l至1mg/l，所述激动素的浓度为0.05mg/l至0.5mg/l；

7.一种萝卜游离小孢子的培养方法，其特征在于，包括步骤：采用如权利要求1至6任一项中所述的培养基培养萝卜小孢子以形成胚状体。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法还包括步骤：

9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述分化培养所采用的培养基为包含浓度为20mg/l至80mg/l的头孢噻胯、80g/l至150g/l的蔗糖、0.05mg/l至0.2mg/l的6-苄氨基嘌呤以及0.2mg/l至1mg/l的萘乙酸的b5培养基。

10.一种萝卜ogura cms类型保持系的创制方法，其特征在于，包括步骤：

技术总结
本申请公开了一种培养基、萝卜游离小孢子的培养方法及Ogura CMS类型保持系的创制方法，培养基为包含80g/L至150g/L的蔗糖、0g/L至0.4g/L的活性碳以及0.1mg/L至1.0g/L的生长调节剂的1/2NLN培养基，生长调节剂选自吗啉乙磺酸、两性霉素B、褪黑素、萘乙酸、6‑苄氨基嘌呤、吲哚乙酸、激动素、丁酸钠或硝酸银中的至少一种，所述培养方法包括步骤：采用培养基培养萝卜小孢子以形成胚状体，能够有效提升萝卜小孢子的出胚率，OguraCMS类型保持系的创制方法仅需1～2年即可选育获得纯合、稳定的优良萝卜Ogura CMS类型保持系，极大地缩短了育种年限，有效地提升了育种效率。

技术研发人员：范伟强,王超楠,黄志银,张红,张斌,刘晓晖,尹婧
受保护的技术使用者：天津科润农业科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24