苏云金芽孢杆菌在土壤溶磷、促进植物生长和调节土壤酶系代谢中的应用

1.本发明属于植物促生菌技术领域，尤其涉及苏云金芽孢杆菌在土壤溶磷、促进植物生长和调节土壤酶系代谢中的应用。


背景技术：

2.磷是植物生长发育的必需营养元素之一，土壤中约有95％以上的磷是以不易被植物体直接吸收利用的形态存在，生产上只能通过施用磷肥来提供植物所需的大量磷素。然而，施入的磷肥当季利用效率仅为5％～25％，成本高、有效转化率低、浪费严重，而且磷肥的过度使用会对土壤和水体环境造成严重的污染。
3.根际是土壤中靠近植物根部的区域，它是土壤和植物根部之间的界面。某些土壤微生物能够将植物难以吸收利用的磷元素转化成可以被吸收利用的形态，这类微生物称为解磷微生物或解磷菌，这些有益微生物统称为pgpr(plant growth-promoting rhizobacteria，pgpr)。pgpr利用微生物途径能够促进土壤累积磷的释放和有效化，发掘作物自身潜力，减少土壤对磷的固定，发挥根系分泌物对土壤磷活化机制，实践意义重大。越来越多的科研工作者对解磷微生物进行了深入的研究，目前，解磷菌的筛选及应用主要集中在玉米、小麦等肥力较高土壤，尚鲜见贫瘠土壤筛选解磷菌的研究。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供从干旱瘠薄土壤中筛选获得的高效解磷菌苏云金芽孢杆菌在土壤溶磷、促进植物生长和调节土壤酶系代谢中的应用。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了苏云金芽孢杆菌在土壤溶磷、促进植物生长或调节土壤酶系代谢中的应用。
7.优选的，所述苏云金芽孢杆菌包括苏云金芽孢杆菌tg-5。
8.优选的，所述促进植物生长包括提高植物根长、干鲜重和叶绿素含量。
9.优选的，使用苏云金芽孢杆菌的发酵液发挥土壤溶磷、促进植物生长或调节土壤酶系代谢作用。
10.优选的，所述发酵液经由如下步骤制备所得：将苏云金芽孢杆菌接种于发酵培养基中，36℃-39℃、180r/min-220r/min振荡培养8h以上即得。
11.优选的，所述发酵培养基包括c源、n源和无机盐，所述c源包括酵母提取物、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖或玉米粉。
12.优选的，所述n源包括胰蛋白胨、尿素、黄豆粉、硫酸铵或牛肉膏。
13.优选的，所述无机盐包括氯化钠、氯化钙、硝酸镁、硝酸钾、七水硫酸亚铁或磷酸铝。
14.优选的，所述发酵培养基中c源、n源和无机盐的浓度比为5-10:10-15:5-10。
15.本发明的有益效果：
16.本发明的苏云金芽孢杆菌具有极强的解无机磷作用，其解磷作用是普通苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的3倍以上，是解淀粉芽孢杆菌的10.7倍以上。本发明苏云金芽孢杆菌的发酵液能够显著提高植物的生物量和叶绿素含量，另外具有调节土壤酶系代谢的作用。以菠菜为例，本发明苏云金芽孢杆菌的发酵液能够显著提高菠菜的生物量，其中株高、鲜重、干重分别提高了30.6％、46.8％、96.0％；显著增加菠菜叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量，增加率分别为7.0％、23.4％、1.3％；显著提高土壤蔗糖酶、脲酶活性，增长率分别为30.3％、688.6％；显著提高菠菜根系脱氢酶、过氧化氢酶活性，增长率分别为165.5％、15％。
附图说明
17.图1为tg-5菌株培养图片；
18.图2为基于16s rrna基因序列构建的细菌发育树；
19.图3为不同菌株磷素分解吸光度变化；
20.图4为不同碳源、氮源吸光度变化；
21.图5为不同无机盐、培养时间吸光度变化；
22.图6为不同接种量、培养温度对吸光度的影响；
23.图7为不同ph值、转速对吸光度的影响；
24.图8为培养基各组分比优化的正交试验结果；
25.图9苏云金芽孢杆菌发酵液处理对菠菜株高、根长、干鲜重的影响；
26.图10为苏云金芽孢杆菌发酵液处理对菠菜叶绿素的影响；
27.图11为苏云金芽孢杆菌发酵液对菠菜根际土壤酶代谢影响；
28.图12为苏云金芽孢杆菌发酵液处理对菠菜土壤理化性质的影响。
具体实施方式
29.本发明提供了苏云金芽孢杆菌在土壤溶磷、促进植物生长或调节土壤酶系代谢中的应用。
30.本发明所述苏云金芽孢杆菌分离自山东省泰安市天外村常年生长植株根际，具有溶磷、木质素纤维素分解和产生生长素能力，有助于养分活化及促进植物生长。本发明中，所述苏云金芽孢杆菌优选的为苏云金芽孢杆菌tg-5。在本发明中，苏云金芽孢杆菌tg-5的全基因组已公开，其中登记号为gwhbown00000000，苏云金芽孢杆菌tg-5的全基因组核苷酸序列如seq id no.1所示。(本发明tg-5的16s rrna基因序列以登录号rid-8mg9p79f013 query-39355保存在ncbi数据库中，初步鉴定该菌为苏云金芽孢杆菌)。申请人承诺免费对公众公开发放苏云金芽孢杆菌tg-5生物材料。在本发明中，所述促进植物生长优选的包括提高植物根长、干鲜重和叶绿素含量，所述土壤酶系优选的包括蔗糖酶、脲酶、脱氢酶和过氧化氢酶。
31.在使用本发明所述苏云金芽孢杆菌进行土壤溶磷、促进植物生长或调节土壤酶系代谢时，优选的使用苏云金芽孢杆菌的发酵液发挥作用。在本发明中，所述苏云金芽孢杆菌的发酵液优选的经由如下步骤制备所得：将苏云金芽孢杆菌接种于发酵培养基中，36℃-39
℃、180r/min-220r/min振荡培养8h以上即得。
32.在本发明中，所述发酵培养基优选的包括c源、n源和无机盐，所述c源、n源和无机盐的浓度比优选为5-10:10-15:5-10。所述c源优选的包括酵母提取物、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖或玉米粉；所述n源优选的包括胰蛋白胨、尿素、黄豆粉、硫酸铵或牛肉膏；所述无机盐优选的包括氯化钠、氯化钙、硝酸镁、硝酸钾、七水硫酸亚铁或磷酸铝。在本发明中，所述发酵的温度优选为37℃-38℃，所述发酵的转速优选的为220r/min。
33.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
34.下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
35.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.实施例1
37.无菌条件下取山东省泰安市天外村常年生长植株根际土5g，溶于45ml无菌蒸馏水中，220r/min，振荡培养30min。用移液器吸取100μl的土壤稀释液于各分离培养基平板中央，涂布器涂抹均匀，37℃恒温培养1～3d。细菌分离采用lb固体培养基，放线菌分离采用高氏一号培养基，选用的稀释度为10-4
、10-5
和10-6
；真菌分离采用马丁氏培养基，选用的稀释度为10-3
、10-4
和10-5
。
38.从lb固体培养基和pda固体培养基共分离出92株菌。通过纤维素刚果红培养基、产纤维素酶发酵培养基、ashby无氮培养基、解无机磷细菌分离培养基、硅酸盐细菌分离培养基作为筛选条件，同时满足五种条件者为高效促生目标菌株苏云金芽孢杆菌tg-5。
39.将筛选出的促生菌株接种于lb固体培养基上，37℃培养48h后根据《伯杰氏系统细菌鉴定学手册》菌落观察并进行革兰氏染色和芽孢染色，结果如图1所示，形态学鉴定显示：tg-5革兰氏染色阳性，在lb培养基上37℃培养24h后，单菌呈乳白色、不透明、不规则、隆起、边缘波状。显微镜观察发现，菌落为圆形或者椭圆形，淡黄色，边缘不规则，不透明微隆起呈滴蜡状。
40.然后按照《微生物学实验教程》和《土壤农业化学分析方法》进行生理生化鉴定。结果如表1所示。
41.表1 tg-5生理生化鉴定结果
42.[0043][0044]
注：表内“+”表示为阳性，
“‑”
表示为阴性。
[0045]
由表1可以看出，对菌株tg-5的部分促生功能进行鉴定后，淀粉水解实验中，淀粉培养基中出现透明圈，呈阳性；甲基红实验中溶液呈现黄色，为阴性。测定解磷能力是，有机磷培养基中呈现透明圈，为阳性。菌株tg-5具有溶磷、木质素纤维素分解和产生生长素能力，有助于养分活化及促进植物生长。
[0046]
采用艾科瑞公司的细菌基因组dna提取试剂盒进行菌株基因组dna的提取。以提取的dna作为模板，以细菌的通用引物27f/1492r对菌株的16srrna基因进行pcr扩增。将pcr产物送往北京擎科生物科技有限公司进行测序，测序结果在ncbi blast进行对比，通过软件mega-x进行序列相似性分析，并构建系统发育树。结果如图2所示。初步鉴定筛选获得的芽孢杆菌tg-5为苏云金芽孢杆菌。
[0047]
实施例2
[0048]
将实施例1分离获得的苏云金芽孢杆菌tg-5活化后，以1％比例接种于以磷酸钙作为唯一磷源的液体无机磷培养基(液体无机磷培养基(g/l)：葡萄糖10.0，酵母提取物0.5，磷酸钙5.0，硫酸铵0.5，氯化钾0.2，硫酸镁0.1，硫酸锰0.0001，硫酸亚铁0.0001)，37℃、180r/min振荡培养5d后开始取样，4000r/min离心10min，取上清液钼锑抗比色法检测可溶性磷浓度。设置市售常规苏云金芽孢杆菌(bacillus thringiensis,简写为bt)，地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis,简写为bl)，解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens,简写为ba)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis,简写为bs)作为对照组。结果如图3所示。
[0049]
由图3可以看出，本发明苏云金芽孢杆菌tg-5培养基中可溶性磷含量为248.2mg/l，是市售常规苏云金芽孢杆菌(79.1mg/l)、地衣芽孢杆菌(51.1mg/l)和枯草芽孢杆菌(34.5mg/l)的3倍以上，是解淀粉芽孢杆菌(23.2mg/l)的10.7倍以上。
[0050]
实施例3
[0051]
以液体培养基(在950ml ddh2o中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和nacl 10g，用1m的naoh调节ph值到7.0，定容至1l)为对照，将对照液体培养基中的酵母提取物(yeast extract)分别换成等量(5.0g/l)的可溶性淀粉(soluble starch)、麦芽糖(malt dust)、葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)和玉米粉(corn flour)；每250ml三角瓶装100ml，按照2％种子液接种量接种苏云金芽孢杆菌，30℃，180r/min摇床上振荡12h，测定发酵反应液的od 600值，3次重复，筛选出最佳c源。结果如图4左所示。
[0052]
将对照液体培养基中的胰蛋白胨(tryptone)分别换成等量(10g/l)的尿素(urea)、黄豆粉(soybeanpowder)、硫酸铵(ammonium sulphate)和牛肉膏(beefpaste)，发酵反应条件同c源的筛选，筛选出最佳氮源。结果如图4右所示。
[0053]
将对照液体培养基中的氯化钠(sodium chloride)分别换成等量(5.0g/l)的氯化钙(calcium chloride)、硝酸镁(magnesiumnitrate)、硝酸钾(potassium nitrate)、七水硫酸亚铁(ferrous sulfate heptahydrate)和磷酸铝(aluminum phosphate)，发酵反应条件同c源的筛选，筛选出最佳无机盐。结果如图5左所示。
[0054]
由图4和图5可以看出，本发明苏云金芽孢杆菌发酵培养基的最佳碳源为玉米粉、最佳氮源为黄豆粉、最佳无机盐为氯化钙。
[0055]
实施例4
[0056]
以苏云金芽孢杆菌菌种生长量为指标，探究发酵培养转速、ph、培养温度、培养时间、接种量对菌种生长量的影响。
[0057]
以实施例3所得最佳培养基(在950ml ddh2o中加入大豆粉10g、玉米粉5g和氯化钙10g，用1m的naoh调节ph值到7.0，定容至1l)作为发酵培养基，每250ml三角瓶装100ml，按照2％种子液接种量接种苏云金芽孢杆菌，30℃，180r/min摇床上振荡12h，测定发酵反应液的od 600值，3次重复。分别设置不同的转速、ph、培养温度、培养时间、接种量，结果如图5右-图7所示。本发明苏云金芽孢杆菌发酵培养时的最佳培养条件为接种量5％、37℃、ph为7.0、转速为220r/min，菌株培养2-8h进入对数生长期。
[0058]
实施例5
[0059]
以实施例3所得的最佳c源、n源和无机盐作为发酵培养基的组分，进行三水平三因素的正交试验，以实施例4所得的最佳发酵条件进行发酵，以生长量为指标，测定发酵反应液的od 600值，3次重复。其中最佳c源：玉米粉、n源：黄豆粉和无机盐：氯化钙的用量如表2所示。结果如图8所示。最佳组合为a3b3c3，即玉米粉(10.0g/l)，黄豆粉(15.0g/l)，氯化钙(10.0g/l)。
[0060]
表2发酵培养基中各组分的正交实验因素与水平
[0061][0062]
实施例6
[0063]
盆栽试验
[0064]
将促生菌株苏云金芽孢杆菌接种于液体培养基(在950ml ddh2o中加入大豆粉10g、玉米粉5g和氯化钙10g，用1m的naoh调节ph值到7.0，定容至1l)中，37℃，180r/min振荡培养48小时，测得活菌数为2
×
10
11
cfu/ml，得苏云金芽孢杆菌发酵液，盆栽试验备用。
[0065]
实验设计：
[0066]
试验于2022年1月-5月进行，试验目标植物为菠菜，均匀撒种在直径为20厘米，高为30厘米的塑料花盆中，盆中分别装满沙土和壤土2.5千克、1千克，共设6个处理：普通土(对照,ck)；0.2
×
108cfu/ml；0.5
×
108cfu/ml；1
×
108cfu/ml；2
×
108cfu/ml；5
×
108cfu/ml，每处理3个重复，期间不再添加任何肥料，采用滴灌浇水，正常管理。
[0067]
盆栽幼苗生长30天后，每处理取3盆采集土壤和植株样品。同时去掉处理的土壤样品，过2mm筛后等量混匀，风干，用于土壤酶活性的测定；植株样品整株采集，用清水将根部土壤清洗干净，用直尺测定每株作物的株高、根长，用电子天平测定鲜重，把测量完现重的作物105℃杀青30min，70℃烘箱烘干至恒重后测量干重。结果如图9所示。苏云金芽孢杆菌发酵液的施用对菠菜株高和根长的促进作用明显，分别增加30.6％、16.7％；鲜重、干重分别提高了46.8％、96.0％。
[0068]
叶绿素含量的测定：每个处理组采集同位叶片的叶尖，剪碎后各称取0.2克，进行叶绿素的提取，将叶绿素提取液注入比色皿，以95％乙醇为空白对照，测定665、649nm的吸光度。结果如图10所示，苏云金芽孢杆菌发酵液施用对菠菜叶绿素的影响在t1梯度下为增加，伴随着浓度增加，叶绿素呈下降趋势。
[0069]
土壤酶活性测定：土壤酶活的测定参照关松荫的方法。土壤蔗糖酶活性的测定采用比色法，以1d后1g土壤中所生成葡萄糖的质量(mg)表示蔗糖的酶活性，用mg/g/d表示。土壤脲酶活性测定采用比色法，以1d后土壤所生成nh
3-n的质量(mg)表示脲酶活性，用mg/g/d表示。土壤碱性磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法，以1d后1g土壤中的p2o5毫克数表示磷酸酶活性，用mg/g/d表示。土壤过氧化氢酶活性测定采用高锰酸钾滴定法，以1g土壤每分钟消耗的h2o2毫克数表示过氧化氢酶活性，用mg/g/d表示。
[0070]
根系酶活性测定：根系超氧化物歧化酶(sod)活性测定采用氮蓝四唑(nbt)法，以抑制nbt光化学还原50％所需的酶量为酶活单位(u)；过氧化物酶(pod)活性测定采用愈创
木酚法，以每分钟酶a470变化0.01为一个过氧化物变化酶活单位(u)；过氧化氢酶(cat)活性测定采用紫外吸收法，以每分钟a240减少0.1的酶量为一个酶活单位(u)；丙二醛(mda)含量的测定采用硫代巴比妥酸(tba)法。结果如图11所示。苏云金芽孢杆菌发酵液施用对菠菜根际土壤酶代谢影响为：脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶整体呈现先升高再降低的抛物线趋势；磷酸酶含量与苏云金芽孢杆菌发酵液施用整体呈现反比例关系；脱氢酶含量与苏云金芽孢杆菌发酵液施用呈现正比例关系。
[0071]
苏云金芽孢杆菌发酵液处理对菠菜土壤理化性质的影响：结果如图12所示。苏云金芽孢杆菌发酵液的施用对菠菜根际土壤养分影响为：土壤速效磷含量呈抛物线趋势，先升高后下降；土壤全氮、有机质、ph整体增长明显。
[0072]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。