1.本发明涉及食用菌领域，特别涉及一种绣球菇菌种的培育方法。
背景技术：
2.绣球菇(sparassis crispa)是一种珍稀的食药两用大型真菌。
3.目前，绣球菇的母种(一级种)通常使用马铃薯琼脂培养基进行培养，培养时间通常为25-30d，原种(二级种)则是以玉米粉、松木屑为主的固体培养基进行培养，培养时间达到50-55d，培养完毕的菌种用于生产使用，导致整个菌种培养周期较长。此外，由于培养的原种(二级种)为固体种，均匀性较差，还导致工业化应用难度较大，生产成本较高。
4.因此设计一种培育周期短、保证菌种品质的培育方法，是本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现要素：
5.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种绣球菇菌种的培育方法，可有效缩短绣球菇的培育时间，且培育得到的菌种满足工业也大规模栽培的需求。
6.本发明的技术方案是：一种绣球菇菌种的培育方法，包括以下步骤：
7.1)制备复合固体培养基
8.取35-40重量份寒天培养基、5-10重量份琼脂粉，加入马尾松提取液中混合，调节ph至5.0
±
0.5，灭菌制成固体培养基待用；
9.2)制备复合液体培养基
10.取10-20重量份葡萄糖、2.5-3.5重量份玉米粉、0.4-0.7重量份硫酸镁，加入马尾松提取液中混合，调节ph至5.0
±
0.5，灭菌制成液体培养基待用；
11.3)取绣球菇母种，接种至步骤1)制备的复合固体培养基上，在封闭环境中，于23-24℃条件下培养20-25d；
12.4)在步骤3)的固体培养基上切割多个接种块，接种至另一复合固体培养基上，在封闭环境中，于23-24℃条件下培养15-20d；
13.5)在步骤4)的固体培养基上从菌丝延伸端朝向中心0.5-1.0cm处切割多个接种块；
14.6)将接种块接种至步骤2)制备的复合液体培养基中，在25-26℃条件下，于自然光环境下振荡培养10-15d，得到绣球菌液体发酵菌种。
15.优选的，步骤1)寒天培养基和马尾松提取液的重量体积比为35-40：1000，制备的固体培养基的厚度为3-4mm。
16.优选的，步骤2)葡萄糖和马尾松提取液的重量体积比为1-2：100。
17.进一步的，步骤1)和/或步骤2)所述马尾松提取液的制备方法为：
18.1)取新鲜、均匀的马尾松木屑，加入水中；
19.2)煮沸后冷却过滤，取滤液，得到马尾松提取液。
20.优选的，步骤1)马尾松木屑和水的重量体积比为1：25。
21.优选的，步骤1)和/或步骤2)使用柠檬酸钠调节ph。
22.优选的，步骤6)通过打孔得到接种块，接种块的直径为6mm。
23.优选的，步骤7)振荡频率为150r/min。
24.采用上述技术方案具有以下有益效果：
25.1、本发明培育方法，绣球菇母种先通过复合固体培养基活化，再转接至复合固体培养基培养复壮，最后接种至复合液体培养基中进行扩大培育得到可用于常规栽培的菌种，使整个育种周期缩短至45-60d，可有效缩短绣球菇的培育时间。
26.2、复合液体培养基利用菌种发酵技术，实现液体菌种高效发酵，缩短绣球菌菌种的培养周期，整个菌种阶段培养45-60d，与传统固体培养周期为75-85d相比大幅缩短了育种周期。发酵得到的菌液菌丝含量1.2-1.5g/ml，可直接接种绣球菌栽培料进行培养出菇。
27.3、绣球菇喜针叶树木屑，并且适宜在偏酸性条件下生长，最适ph值4.5-6.0。本发明中的培养基配方均使用马尾松提取液，满足绣球菌菌种对针叶树的需求，用柠檬酸钠调节ph值为弱酸性，满足菌丝生长条件，且促进绣球菇菌种在最适条件下进行液体发酵，从而达到较高的发酵效率。
28.4、液体菌种具有周期短、菌龄一致、接种方便的特点。液体菌种接种后，由于液体流动性强、易分散、萌发快、定植快，并且菌龄一致，所以出菇均匀性较好。液体菌种具有较好的流动性和分散性，能分散到栽培料中心孔以及底部，菌丝多点生长，萌发快，整体均匀性较好，出菇周期以及均匀性也更好。
29.下面结合具体实施方式作进一步的说明。
具体实施方式
30.本发明中，使用重庆华绿生物有限公司自繁绣球菇试管母种。
31.实施例1
32.制备马尾松提取液
33.选取新鲜且粗细均匀、干燥、无杂质和异味的马尾松木屑，颗粒度无要求，水份含量≤50％。加入纯净水中，按照马尾松木屑、纯净水的质量体积比为1：25进行混合，煮沸20min后，冷却过滤，取滤液，待用。
34.1)制备复合固体培养基
35.取38.5g寒天培养基，6.0g琼脂粉，加入1l马尾松提取液中混合，使用柠檬酸钠调节ph至5.0
±
0.5，分装至1000ml的三角瓶中，每个三角瓶中装500ml，用棉塞和铝箔纸包扎后，于121℃条件下灭菌20min，自然冷却至50-60℃，分装至试管、平板中，待培养基凝固前将试管倾斜摆放，形成斜面培养基，平板培养基的厚度为3-4mm，冷却凝固待用。
36.2)制备复合液体培养基
37.取15g份葡萄糖、3.0g玉米粉、0.5g硫酸镁，加入1l马尾松提取液中混合，用柠檬酸钠调节ph至5.0
±
0.5，分装至1000ml三角瓶中，每个三角瓶中装500ml，用棉塞和铝箔纸包扎后，于121℃条件下灭菌20min，自然冷却。
38.3)取公司自繁绣球菇母种试管，将绣球菇母种切割至3mm*3mm*3mm的接种块，用接种针挑接种块，置于试管斜面复合固体培养基的中心，试管竖直放置于23.5℃的生化培养
箱中培育至菌丝萌发、生长至达到转接要求，约23d，得到一级种。
39.4)将一级种切割至3mm*3mm*3mm的接种块，用接种针挑接种块，置于平板复合固体培养基的中心，并封好封口膜，置于23.5℃的生化培养箱中培育至菌丝萌发、生长并达到转接要求，约18d，得到二级种。
40.5)用直径为6mm的打孔器，在二级种固体培养基上从菌丝延伸端朝向中心0.5-1.0cm开始打孔，每个孔相切，最终形成一个环形，用接种针轻轻挑起接种块，在火焰保护下接入摇瓶复合液体培养基中，每个三角瓶中接入5个接种块，三角瓶置于25.5
±
0.5℃的恒温振荡器上，在自然光条件下培育15d，振荡频率为150r/min，得到绣球菌三级种(即液体发酵菌种)。
41.6)将摇瓶中的绣球菌液体发酵菌种摇匀，取5ml菌球悬浮液，配重后置于离心机中，2500r/min离心2min，倒掉上清液后称重，检测菌丝含量1.37g/ml。
42.实施例2
43.取实施例1制备得到的绣球菇菌种，按照袋栽绣球菌工厂化生产技术规程栽培。
44.1)栽培料配方为：松木屑85％，麸皮5％，玉米粉5％，麦粒5％(1mm≤颗粒度≤2mm)，柠檬酸钠调解ph值5.0
±
0.5。装袋重量950g/袋，装料后料面平整，留中心孔，装料高度约15cm，袋口离料面约10-15cm。每袋接种液体菌种35
±
5g。
45.2)菌丝阶段培养条件：培养温度23
±
0.5℃，空气相对湿度50-65％，避光，通风频率1/25。
46.3)出菇阶段培养条件：菌丝长满后，培养温度调至21
±
0.5℃，空气湿度75-85％，全天给予400lx白光光照。开始出菇后，将袋口套环取下并将袋口拉直，后用橡皮筋固定袋口和栽培料接触位置，待子实体长至袋口时将袋口划破。待子实体长至采收要求时采收。
47.菌丝阶段培养周期35d，出菇阶段培养周期25d，共60d后即可采收子实体。
48.对比例1
49.1)母种培养基制备：38.5g寒天培养基，6.0g琼脂粉，加入1l纯净水，用柠檬酸钠调节ph 5.0
±
0.5。灭菌后制备试管斜面培养基。将公司自繁母种试管培养基接种到母种培养基中，23.5
±
0.5℃培养，20-30d，制备一级种。
50.2)固体原种培养基制备：松木屑85％，麸皮5％，玉米粉5％，麦粒5％(1mm≤颗粒度≤2mm)，柠檬酸钠调节ph值5.0
±
0.5，装料450g/袋，留中心孔，灭菌后将步骤1)中制备的一级种接种至固体培养基中，制备二级种。培育温度23
±
0.5℃，培育50-55d，空气相对湿度50-65％，避光，通风频率1/25，制备固体原种。
51.对比例2
52.取对比例1制备的固体原种，同实施例2使用相同的栽培料配方、菌丝培养、出菇培养条件进行出菇培养。每袋接种固体菌种15
±
5g。
53.对比例1菌丝阶段培养周期45d，出菇阶段培养周期30d，共75d后可采收子实体。