一种可视化GVHD动物模型的构建方法及其应用

本发明属于医学和生物实验模型的制备，尤其涉及一种可视化gvhd动物模型的构建方法及其应用。

背景技术：

1、移植物抗宿主病(gvhd)的发生主要原因是移植物中供者免疫活性细胞攻击受者靶器官和组织，是多细胞、多因子参与的复杂病理过程。在gvhd发生过程中，按其发生先后可分为三个阶段：(1)既往治疗和放化疗等预处理所致组织细胞损伤，导致炎症细胞因子大量释放，促进供者或受者抗原递呈细胞(antigen presenting cells，apc)成熟与活化，进而增强供者t淋巴细胞对受者抗原识别能力。(2)抗原递呈后供者t淋巴细胞活化与增殖，分泌大量炎症细胞因子，致使th1、th2类细胞因子分泌失衡，促进gvhd发生发展。(3)效应细胞及细胞因子介导靶组织损伤的效应阶段。此阶段，供者t细胞通过穿孔素/颗粒酶、fas/fasl及tnf-α三大途径杀伤受者靶细胞。以上三个阶段密切相关，并具有逐级放大功能，最终导致靶器官与组织损伤，形成局部或者全身性gvhd。可见，供者t细胞的过度活化是整个gvhd发生过程中的关键。因此，了解供体t细胞在活体内的分布、扩增、活化及迁徙规律对于阐明gvhd的发展状态和发生机制非常重要。

2、并且，由于t细胞进入受者体内易受到多种因素影响，许多生物学特性只能在体内表现出来，体外研究所获取的功能信息无法完全模拟体内生理或病理环境下的免疫信号和细胞结构改变，所以t细胞在活体内的动态研究和观察十分必要。但目前能够实现体内水平t细胞直接示踪的方法仍然较少，常用方法主要通过血清细胞因子水平，靶器官组织切片等手段间接反映t细胞增殖及浸润情况。并且，近年来，随着多种个体化医疗手段不断兴起，细胞治疗也逐渐成为gvhd的有效治疗手段，但过继性输注的细胞在体内的分布及迁移规律也尚未完全明确。因此，开发一种能够实现实时动态监测t细胞在体增殖活化的新型成像手段迫在眉睫，并且通过成像手段实现过继性输注细胞在体动态实时成像也十分必要，也是研究过继性输注细胞与供体t细胞共定位的有利手段。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可视化gvhd动物模型的构建方法，可实现供者t细胞和过继性输注细胞在受者体内的实时生物学行为监测。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种可视化gvhd动物模型的构建方法，包括以下步骤：小鼠以8gy60coγ射线辐照后，输注细胞悬液，得到可视化gvhd小鼠模型；所述细胞悬液由去除t细胞后的骨髓细胞和被eqfp650、hsv-tk与gluc报告基因标记的t细胞混合得到。

4、优选的，所述辐照剂量率为60～62cgy/min，照射时间为12～13min。

5、优选的，所述细胞悬液中去除t细胞后的骨髓细胞数量为4.5～5.5×106个。

6、优选的，所述细胞悬液中被eqfp650、hsv-tk与gluc报告基因标记的t细胞数量为1.5～2.5×107个。

7、优选的，所述细胞悬液输注方式为尾静脉过继性输注。

8、优选的，所述去除t细胞后的骨髓细胞的制备方法包括：分离小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，通过磁珠阳选的方法去除t细胞。

9、优选的，所述被eqfp650、hsv-tk与gluc报告基因标记的t细胞的制备方法包括：采用表达eqfp650、hsv-tk与gluc的慢病毒载体与骨架载体共转染hek293t细胞，制备具有感染性的慢病毒颗粒并感染t细胞。

10、优选的，所述慢病毒载体中，eqfp650和hsv-tk融合表达，启动子为cmv，gluc基因由cmv增强子和颗粒酶b启动子调控。

11、本发明还提供了上述构建方法在研究gvhd发展状态和发展机制，或制备和/或筛选治疗gvhd药物中的应用。

12、本发明还提供了上述构建方法在评价过继性输注细胞治疗异基因移植的gvhd效果中的应用。

13、相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

14、本发明构建的gvhd动物模型具有双成像功能，通过eqfp650蛋白成像可以考察供者t细胞在受者体内的定位及增殖情况，gaussia荧光素酶(gluc)具有分泌性信号肽，可以通过外周血gaussia成像观察供者t细胞在受者体内的活化情况。本发明通过生物发光成像监测供者t细胞在受者体内所呈现的时间和空间上的程序性迁移、聚集和活化，可以从整体水平研究供者t细胞增殖活化与gvhd发生的关系。

15、本发明构建的gvhd动物模型可以同时对多种过继性输注的细胞进行实时监测，如过继性输注携带有fluc基因的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)治疗gvhd，可以同时进行mscs在体内分布的成像，可以观察和量化t细胞与过继性输注的细胞的共定位随时间变化趋势，便于研究两者间的相关关系，明确其具体的促进/抑制效应，并据此评估过继性输注细胞的潜在疗效。

技术特征：

1.一种可视化gvhd动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：小鼠以8gy60coγ射线辐照后，输注细胞悬液，得到可视化gvhd小鼠模型；所述细胞悬液由去除t细胞后的骨髓细胞和被eqfp650、hsv-tk与gluc报告基因标记的t细胞混合得到。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述辐照剂量率为60～62cgy/min，照射时间为12～13min。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞悬液中去除t细胞后的骨髓细胞数量为4.5～5.5×106个。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞悬液中被eqfp650、hsv-tk与gluc报告基因标记的t细胞数量为1.5～2.5×107个。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞悬液输注方式为尾静脉过继性输注。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述去除t细胞后的骨髓细胞的制备方法包括：分离小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，通过磁珠阳选的方法去除t细胞。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述被eqfp650、hsv-tk与gluc报告基因标记的t细胞的制备方法包括：采用表达eqfp650、hsv-tk与gluc的慢病毒载体与骨架载体共转染hek293t细胞，制备具有感染性的慢病毒颗粒并感染t细胞。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述慢病毒载体中，eqfp650和hsv-tk融合表达，启动子为cmv，gluc基因由cmv增强子和颗粒酶b启动子调控。

9.权利要求1～8任意一项所述的构建方法在研究gvhd发展状态和发展机制，或制备和/或筛选治疗gvhd药物中的应用。

10.权利要求1～8任意一项所述的构建方法在评价过继性输注细胞治疗异基因移植的gvhd效果中的应用。

技术总结
本发明提供了一种可视化GVHD动物模型的构建方法及其应用，属于医学和生物实验模型的制备技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：小鼠以8Gy<supgt;60</supgt;Coγ射线辐照后，输注细胞悬液，得到可视化GVHD小鼠模型；所述细胞悬液由去除T细胞后的骨髓细胞和被eqFP650、HSV‑TK与Gaussia荧光素酶(Gluc)报告基因标记的T细胞混合得到。本发明构建的可视化动物模型可以同时对多种过继性输注的细胞进行实时监测，以观察和量化供者T细胞在受者体内的活化和增殖情况，可以从整体水平研究供者T细胞增殖活化与GVHD发生的关系。

技术研发人员：詹林盛,孙苏静,周欠欠,王小慧
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12