脉络膜缺血模型的制备方法与流程

1.本发明涉及生物医学领域中，脉络膜缺血模型的制备方法。


背景技术：

2.脉络膜萎缩是一种常见的眼底病变，与老年性黄斑变性(amd)、视网膜色素变性、病理性近视等疾病的发展密切相关。研究发现amd早期即出现脉络膜血管内皮细胞的丢失。为模拟脉络膜缺血病变，便于治疗技术的研发，迫切需要一个能重现脉络膜血管病变的动物模型，以及局部施加药剂特别是细胞移植和治疗效果评价的方法。脉络膜缺血动物模型的构建和细胞移植治疗方法的建立将对脉络膜萎缩的治疗，对相关疾病的机理研究和临床治疗产生重要的促进作用。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何制备脉络膜缺血的动物模型。
4.本发明首先提供了脉络膜缺血动物模型的制备方法，所述方法包括：向动物脉络膜上腔注射碘酸钠溶液，得到脉络膜缺血动物模型。
5.上述方法中，碘酸钠注射的剂量可为10μg/只眼睛。
6.上述方法中，所述碘酸钠溶液可由溶剂和溶质组成，溶剂可为pbs，溶质可为碘酸钠。
7.所述碘酸钠溶液中碘酸钠的浓度可为10μg/μl。
8.上述方法中，所述碘酸钠溶液注射的位置可在角巩膜缘后2mm，脉络膜上腔。
9.上述方法中，所述动物可为大鼠。所述大鼠具体可为sd大鼠。所述大鼠可为6周龄或以上周龄sd大鼠。
10.具体的，所述脉络膜缺血动物模型的制备方法可包括：剪开球结膜，暴露巩膜，胰岛素针头刺穿巩膜，应用微量注射器向脉络膜上腔注射1μl碘酸钠，术毕，缝合球结膜。
11.利用所述脉络膜缺血动物模型的制备方法制备的脉络膜缺血动物模型在筛选脉络膜缺血药物中的应用，也属于本发明的保护范围。
12.本发明的脉络膜缺血动物模型的制备方法可成功获得脉络膜缺血动物模型。脉络膜缺血动物模型的构建和细胞移植治疗方法的建立将对脉络膜萎缩的治疗，对相关疾病的机理研究和临床治疗产生重要的促进作用。
13.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
14.图1.大鼠眼底荧光造影。正常大鼠眼底荧光造影，可见均匀致密的脉络膜血管网。建模后0-90天大鼠眼底荧光造影，可见脉络膜血管萎缩，黑色的无血管区面积逐渐扩大。
15.图2.大鼠眼球石蜡切片he染色。正常大鼠视网膜、脉络膜、巩膜结构完整，层次清晰。建模后第7-90天，脉络膜厚度变薄，视网膜组织萎缩，结构欠清晰。
16.图3.大鼠脉络铺片免疫荧光。左侧为脉络膜整体图像，上方框线内为脉络膜缺血区，下方框线内为脉络膜正常区。右侧为脉络膜各层次图像，与正常(下方图像)相比，脉络膜缺血区域(上方)：色素上皮细胞失去正常六边形形态，体积变大；脉络膜毛细血管层、中血管层血管萎缩、血管密度降低，大血管层无明显异常。cd34，表示脉络膜血管。
17.图4.眼底荧光造影脉络膜血管密度统计分析。与正常对照大鼠相比，大鼠脉络膜缺血动物模型在建模后0-90天，脉络膜血管密度明显降低，差异具有统计学意义。**p＜0.005，****p＜0.00005。
18.图5.he染色脉络膜厚度统计分析。与正常相比，大鼠脉络膜缺血动物模型脉络膜厚度明显降低，差异具有统计学意义。****p＜0.00005，ns无显著差异。
19.图6.大鼠眼底荧光造影。大鼠脉络膜缺血动物模型经hpsc-ec脉络膜上腔移植治疗后，圆圈标注的缺血区内见新生血管网形成(即下图)。
20.图7.大鼠眼球石蜡切片he染色。与治疗对照组(下方注射细胞培养基)比较，ec治疗组(上方)在移植后的各个时间点，脉络膜厚度有所增加。
21.图8.脉络膜铺片免疫荧光。ec治疗后90天，hpsc-ec整合至大鼠脉络膜血管中。红色：cd34，标记人和鼠的血管内皮；绿色：cd31，标记人的血管内皮。
22.图9.眼底荧光造影脉络膜血管密度统计分析。与脉络膜缺血模型组、治疗对照组(培养液注射)相比，ec治疗组(内皮细胞移植)脉络膜血管密度随时间延长逐渐增加。移植后14d-90d脉络膜血管密度较治疗对照组明显增加，差异具有统计学意义。ns无显著差异，*p＜0.05，**p＜0.005。
23.图10.he染色脉络膜厚度统计分析。ec治疗组(内皮细胞)脉络厚度高于脉络膜缺血组(缺血模型)、治疗对照组(培养液)。移植后7d-90d脉络膜厚度较治疗对照组显著增加，差异具有统计学意义。*p＜0.05，****p＜0.00005。
24.图11.正常人及干性老年性黄斑变性患者眼底荧光造影。
具体实施方式
25.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
26.统计学分析:
27.采用spss19.0对数据进行分析，采用origin 9.1软件进行统计作图。计量资料用(平均值
±
标准差)表示，服从正态分布的计量资料的组件比较采用t检验或方差分析(anova)，不服从正态分布的采用非参数秩和检验。计数资料采用卡方检验。p《0.05为差异具有统计学意义。
28.碘酸钠溶液：碘酸钠1mg，溶于1mlpbs中，得到1mg/ml的碘酸钠溶液。
29.脉络膜内皮细胞悬液：人多能干细胞来源的脉络膜内皮细胞来自清华大学那洁教授实验室。注射细胞浓度为5
×
104/μl。
30.其中，人多能干细胞来源的脉络膜内皮细胞的制备根据清华大学那洁实验室发表的论文f.zhang,y.zhu,j.chen,w.kuang,r.huang,f.duan,y.li,l.wang,h.qiu,x.chen,j.ming,p.liu,y.du,s.c.chang,l.chen,j.na,efficient endothelial and smooth muscle cell differentiation from human pluripotent stem cells through a simplified insulin-free culture system,biomaterials 271(2021)120713.和专利《一种制备血管内皮细胞的方法及其专用试剂盒》(专利号2017113956407)进行，具体步骤为：
31.1.将人多能干细胞用细胞消化液accutase消化成单细胞并计数，以30,000-40,000个/平方厘米的密度接种细胞至matrigel包被的细胞培养皿中，此时细胞培养液为含有10μmy27632的tesr-e8培养基。
32.2.传代后第二天(约16-24小时后)，开始诱导分化(此时为分化第0天)，将含有10μmy27632的tesr-e8培养基的培养液换成含有5ng/ml人骨形成蛋白4(bmp4)的aats培养液，继续培养0.5-1.5天；
33.3.更换含有5ng/ml bmp4和2μm chir99021的的aats培养液继续培养1.5-2.5天；
34.4.用细胞消化液accutase消化收集步骤4的细胞，按照20,000-30,000个细胞/平方厘米的密度接种细胞,此时接种细胞的孔板需要用matrigel包被,所用培养基细胞培养基为含有50ng/ml人血管内皮生成因子(vegf-165)和10ng/ml人成纤维生长因子(bfgf)的aats培养基，继续培养3天，间隔1.5天换一次液。
35.5.将步骤5的细胞消化并传代，照1:2的传代比例传到新的孔板中，注意此时的孔板不需要用matrigel包被。然后用含有50ng/ml人血管内皮生成因子(vegf-165)和10ng/ml人成纤维生长因子(bfgf)的aats培养基继续培养细胞3天，可以得到95％以上cd31+内皮细胞。
36.6.将步骤6的细胞进行消化，收集在15ml离心管中并进行细胞计数，300g离心3分钟，以5
×
104/μl的密度用1640细胞培养基重悬细胞，置于冰上并进行后续移植实验。
37.内皮细胞制备过程中用到的试剂：
38.人胚胎干细胞系h1(简称h1细胞)：美国wicell细胞库，编号：wa01。
39.诱导多能干细胞cd34-ipsc(简称cd34-ipsc细胞)：利用仙台病毒重编程试剂盒(invitrogen，货号：a16517)诱导人脐带血造血干细胞(cd34阳性细胞)重编程获得。
40.rpmi 1640基础培养液(rpmi 1640培养基)：thermofisher公司，货号：11875093。
41.tesr-e8培养液：stemcell公司，货号：05990。
42.rock抑制剂y27632(cas 146986-50-7)：targetmol公司，货号：t1870。y27632的结构式如下：
[0043][0044]
人骨形成蛋白4(bmp4)：peprotech公司，货号：120-05。
[0045]
人血管内皮生成因子(vegf-165)：苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，货号为：c083。
[0046]
人成纤维生长因子(bfgf)：苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，货号为：c779。
[0047]
chir-99021：tocris biosciences公司，货号为：4423/10。chir-99021的结构式如下：
[0048][0049]
细胞消化液accutase：上海翊圣生物科技有限公司，货号为：40506es60。
[0050]
matrigel：bd biosciences公司，货号为：356231。
[0051]
细胞计数板：count star公司，货号：12-0005-50。
[0052]
重组人血清白蛋白:oryzogen公司，货号:hy100c1。
[0053]
转铁蛋白:sigma公司,货号:t1147。
[0054]
维生素c:sigma aldrich公司，货号：a4403。
[0055]
亚硒酸钠:sigma aldrich公司，货号：s5261。
[0056]
100
×
双抗(青霉素/链霉素)：hyclone公司，货号sv30010。
[0057]
aats培养液配方如下：
[0058][0059]
维生素c用细胞培养级水溶解配成50mg/ml的储液，分装保存在-20℃。转铁蛋白用pbs配成1mg/ml储液，分装保存在-20℃。亚硒酸钠配成0.1mg/ml储液，4℃避光保存。
[0060]
实施例1、脉络膜缺血动物模型的建立与治疗
[0061]
1)脉络膜缺血动物模型建立
[0062]
应用健康雄性sprague-dawley(sd)大鼠(6周龄或以上)，用随机数字表法将sd大鼠分为两组，分别为正常对照组，脉络膜缺血模型组，右眼为实验眼。
[0063]
脉络膜缺血动物模型的建立：2％戊巴比妥钠注射液腹腔注射，行全身麻醉。盐酸丙美卡因滴眼液点眼，行术眼表面麻醉。角膜缘后2mm剪开颞侧球结膜，分离筋膜囊，暴露巩膜。应用胰岛素针头，于角膜缘后2mm处刺穿巩膜，至脉络膜上腔。应用微量注射器连接33g针头，向脉络膜上腔注射1mg/ml碘酸钠溶液1μl。
[0064]
造模后在yz20p5眼科手术显微镜观察每只造模大鼠眼底以排除眼底出血。建模后
7、14、30，90天，直接检眼镜检查大鼠眼底情况；眼底荧光造影(荧光素钠眼底荧光造影+吲哚菁绿眼底荧光造影)观察建模后脉络膜缺血情况；行he染色，石蜡包埋，平行于视轴方向切片，厚度约为4μm，视网膜及脉络膜结构完整连续，行he染色，中性树胶封片，光学显微镜观察视网膜、脉络膜结构，尤其是脉络膜血管的改变；行冰冻切片，免疫荧光染色，观察脉络膜血管萎缩情况。
[0065]
实验结果：眼底荧光造影结果显示:正常大鼠眼底可见均匀致密的脉络膜血管网。脉络膜缺血动物模型(ci模型)建模后0-90天，可见脉络膜血管萎缩，黑色的无血管区面积逐渐扩大(图1)。对眼底荧光造影脉络膜血管密度进行统计分析，与正常相比，大鼠脉络膜缺血动物模型脉络膜血管密度明显降低，差异具有统计学意义(图4)。石蜡切片he染色显示：正常大鼠视网膜、脉络膜、巩膜结构完整，组织结构层次清晰。缺血动物模型建模后第7-90天，脉络膜厚度变薄，视网膜组织萎缩，组织结构欠清晰(图2)。对he染色脉络膜厚度进行统计分析，与正常相比，大鼠脉络膜缺血动物模型脉络膜厚度明显降低，差异具有统计学意义(图5)。大鼠脉络铺片免疫荧光显示：正常色素上皮(rpe)细胞呈六边形，细胞间紧密连接；脉络膜毛细血管层、中血管层(血管均匀、致密。脉络膜缺血区域rpe细胞失去正常六边形形态，体积变大；脉络膜毛细血管层、中血管层血管萎缩、血管密度降低，大血管层无明显异常(图3)。为验证本动物模型与临床疾病的相似性，本文同时展示了正常人及脉络膜缺血患者的眼底荧光造影。正常人眼底荧光造影可见清晰、均匀、致密的脉络膜血管网；脉络膜缺血(干性老年性黄斑变性)患者眼底造影可见脉络膜血管萎缩缺血(图11)，本实施例所得动物模型的眼底表现与其一致。
[0066]
表明，脉络膜缺血模型组大鼠成功获得了脉络膜缺血大鼠模型。选取出现脉络膜萎缩，但未出现脉络膜新生血管模型构建条件，用于后续实验。
[0067]
2)脉络膜上腔注入人多能干细胞分化的内皮细胞治疗脉络膜缺血
[0068]
将步骤1)获得的脉络膜缺血大鼠模型腹腔注射10％水合氯醛(0.4ml/kg)深度麻醉后，盐酸奥布卡因点眼。采用34g皮下注射针头(针长12.7mm，针头斜度450，针头连接在10μl hamilton玻璃微量注射器上)向鼠眼脉络膜上腔注入1μl人多能干细胞来源的脉络膜内皮细胞(hpsc-ec)悬液(ec治疗组)。另外设有正常对照组、治疗对照组和脉络膜膜缺血组，治疗对照组向脉络膜上腔内注入1μl培养基。
[0069]
分别于术后第7、14、30、90天行眼底荧光造影(荧光素钠眼底荧光造影+吲哚菁绿眼底荧光造影)观察治疗后脉络膜血液供应情况；行石蜡切片he染色，观察视网膜、脉络膜结构，尤其是脉络膜血管的改变；行冰冻切片，免疫荧光染色，观察脉络膜血管情况。免疫荧光抗体：human cd31(1:500,santa cruz sc81158),cd34(1:500,abcam,ab81289),stem101(1:100,takara,japan),ca4(1:500,r&d mab21861),rgcc pv-1(1:50,abcam ab81719),phalloidin 647-conjugated(1:200,abcam,ab176759),dylight 488-or549-conjugated secondary antibodies(earthox),dapi(sigma)。通过以上实验方法对干细胞来源的脉络膜内皮细胞对脉络膜缺血动物模型治疗效果进行分析。
[0070]
实验结果：眼底荧光造影显示，大鼠脉络膜缺血动物模型经hpsc-ec脉络膜上腔移植治疗后，缺血区内新生血管网形成(图6)。对眼底荧光造影脉络膜血管密度进行统计分析，与脉络膜缺血组、治疗对照组相比，ec治疗组脉络膜血管密度随时间延长逐渐增加。移植后14d-90d脉络膜血管密度较治疗对照组明显增加，差异具有统计学意义(图9)。石蜡切
片he染色显示，与单独注射培养基的对照组比较，ec治疗组在移植后的各个时间点，脉络膜厚度有所增加(图7)。对he染色脉络膜厚度统计分析，ec治疗组脉络厚度高于脉络膜缺血组、治疗对照组，移植后7-90天脉络膜厚度较治疗对照组显著增加，差异具有统计学意义(图10)。脉络膜铺片免疫荧光显示，hpsc-ec治疗后90天，hpsc-ec整合至大鼠脉络膜血管中(图8)。红色：cd34，标记人和鼠的血管内皮；绿色：cd31，标记人的血管内皮。
[0071]
结果显示：应用构建的脉络膜缺血动物模型，成功进行脉络膜缺血疾病的治疗研究。
[0072]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。