一种脑小血管病散弹式血管栓塞大鼠模型的建立方法和应用与流程

本发明公开了一种大鼠模型的建立方法和应用，具体为一种脑小血管病散弹式血管栓塞大鼠模型的建立方法和应用。属于医学建模。

背景技术：

1、脑小血管是指脑小穿支动脉和小动脉(直径40-200μm)、毛细血管和小静脉，它们构成了脑组织血供的基本单位，对脑功能的维持起着重要的作用，脑小血管病(cerebralsmall vessel diseases，csvd)是指由于上述脑内小血管病变所导致的临床、影像和病理表现的综合征，主要表现为急性腔隙性脑梗死或出血、腔隙、脑白质高信号、脑微出血、血管周围间隙、脑萎缩和脑微梗死[1]。随着人口老年化的加速和脑血管疾病危险因素的高发，csvd日益增多，研究者发现csvd是卒中发生和复发的重要危险因素，是血管性认知功能障碍和痴呆的主要原因[2,3]，同时还存在着巨大的死亡率风险[4][5]。研究表明，一些传统的危险因素在csvd的发病中起重要的作用[6]。然而，直到最近csvd的分子、细胞和病理生理机制仍然不清楚。由于在活体观察小血管方面存在极大的困难，而脑小血管动物模型建立方面存在技术挑战，因此csvd发病机制研究受到阻碍，从而导致诊断和治疗策略十分有限[3]。

2、经典的csvd发病假说认为它是由脑血流减少和脑自动调节功能受损引起的，血脑屏障的通透性增加也在csvd发病中发挥重要作用[7]。根据csvd的发病机制，在目前的研究中，学者大多选择以下三类不同的动物模型来模拟csvd。第一类基于csvd脑灌注不足及缺血性损伤的特点，包括双侧颈总动脉闭塞(bilateral common carotid arteriesocclusion，bccao)、双颈动脉+双椎动脉闭塞(4vessels occlusion，4.vo)模型等。其中，bccao是模拟人类因动脉管腔狭窄、慢性低灌注等因素导致的csvd，但该模型脑小血管损伤缺乏纤维素样坏死、玻璃样变、淀粉样物质沉积等csvd病理学特征。第二类是基于以高血压为基础的csvd损伤特点，包括自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，shr)模型及易卒中亚型大鼠(spontaneously hypertensive stroke-prone rats，shrsp)模型。虽然shrsp的血管病变与人类csvd类似，能够模拟临床患者高血压引起的csvd早期发病阶段，但该模型卒中的发生时间、部位和病理学特征变异较大,而高血压可能在更早期已经影响了大血管及小血管病理学，不能完全模拟csvd的特点。第三种方法是通过基因突变来设计csvd的特点，如notch3转基因小鼠表达突变notch3基因，能够模拟经典的遗传性csvd之一--常染色体显性遗传病合并皮质下梗死和白质脑病(cerebral autosomaldominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，cadasil)的病理生理过程，这类基因工程模型鼠的优点在于遗传背景及病理改变明确，缺点在于不能反映临床上最为常见的小动脉粥样硬化型脑小血管病的病理生理过程，故一般只适合于研究遗传性csvd。总之，迄今为止，基础研究仍然缺乏能更好地模拟人类csvd过程的实验动物模型[8]，由此导致学者对csvd脑损害的病理生理机制依然不清楚，进而无法详细地揭示其发病机制，影响csvd的临床诊断标准和治疗方法的建立[9]。因此，建立一种模拟人类csvd病理生理的动物疾病模型对于深入探索csvd的细胞-分子机制具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种脑小血管病散弹式血管栓塞大鼠模型的建立方法和应用。以解决现有技术的上述技术问题。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

3、一种脑小血管病散弹式血管栓塞大鼠模型的建立方法，其步骤为：

4、1.准备工作

5、(1)动物分组：选取spf级9周龄雄性自发性高血压大鼠(shr)60只，9周龄成熟雄性sd大鼠15只，60只9周龄雄性shr大鼠适应性饲养1周后，随机分为4组(基于大鼠脑小血管直径设计分组)(假手术组(sham，n＝15)、大粒径模型组(d＝70um-100um，group l，n＝15)，中粒径模型组(d＝40um-70um，group m，n＝15)，小粒径模型组(d＝20um-40um，group s，n＝15))，每组15只，以sd大鼠为正常对照组(normal，n＝15)。

6、(2)采用微纳米材料的特定元素杂化新方法，完善稀土掺杂的nagdf4、bagdf5等纳米材料的粒径、结构、成分和荧光、mri和ct造影性能；设计寡聚赖氨酸、精氨酸、含赖氨酸与精氨酸的短肽片段等及负载csvd多重影响生物因子的微纳米组装方法，完成生物相容性良好的、荧光显微与临床影像(ct/mri、超声等)多功能无损示踪特性、可负载csvd影响生物因子(hs-crp和lp-pla2)的微纳米载体研究，其表征方法包括微纳米粒子的粒径及其分布、微观形貌、结构元素分析、表面化学组成、荧光性能、影像性能、csvd生物因子负载效率、细胞毒理性、血液相容性等系列。

7、(3)实验动物的筛选：用跳台在实验前对大鼠进行学习及记忆力的测试，取内径40cm，底部装有铜栅线圈的无色透明带盖的跳台装置，内置直径5cm，高10cm的橡皮垫作为跳台，每次将一只大鼠放入，设定电刺激参数为电压36v、电流20ma、周期20s、串长3.5～4.5s。接通电源后，跳台底部线圈即可带电，大鼠足底由于电刺激疼痛，会躲闪跳跃，当跳到绝缘台子上即可躲避电击疼痛刺激。1次/天训练大鼠，每次持续30min，让大鼠学会跳到跳台上躲避电刺激，连续训练3天后，第4天进行测试，测试时间为30min，在30min内，以能在跳台上连续停留10min以上的大鼠为学习记忆力合格大鼠，不能在跳台上连续停留10min的大鼠为学习记忆力不合格大鼠，剔除不用，按照此方法挑选出合格大鼠进入下一步实验。

8、2.csvd大鼠模型的制备

9、(1)大鼠以气体麻醉后，分别钝性分离双侧颈总动脉(common carotid artery，cca)、颈内动脉(internal carotid artery，ica)和颈外动脉(external carotid artery，eca)近心端，并于近心端游离一段颈外动脉约0.5cm。将颈外动脉游离端拉至与颈内动脉成一条直线，并在颈外动脉处剪口，1ml注射器逆行注入微纳米粒子盐水混悬液15mg/0.5ml后，立即结扎颈外动脉，同时开放颈总动脉夹，使微纳米粒子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，造成多灶性栓塞性卒中模型。栓塞过程中动物保持麻醉状态，用普通台灯(100w)照射，术后用电热毯，以保持动物体温在37℃。假手术组手术后颈外动脉注射生理盐水，正常组不进行任何手术操作。

10、(2)脑血流监测：采用多普勒血流仪动态监测大鼠的局部脑血流，以前囟为坐标原点，选取前囟后l mm，右侧2mm为测定点，定位并固定好探头座。稳定激光多普勒血流仪(laser doppler flowmetery，ldf)读数后记录10min内血流值，以其平均值作为脑血流的基础值(baseline value)。每只大鼠的脑血流以外源性栓子注入后测得值占脑血流基础值的百分率即相对脑血流(relative regional cerebral blood flow，rcbf)表示，连续监测60min，选取外源性栓子注入完毕后0min，10min，20min，30min，40min，50min和60min血流值做统计。

11、(3)模型制备成功的大鼠的筛选：在术后24小时，将所有模型制备的大鼠用跳台实验进行模型制备合格的筛选，以30min大鼠能在跳台上连续停留时间少于10min为模型制备合格动物，剔除动物的数量依次补充，进入下一步实验。

12、(4)he染色：分别在手术后1d，7d，14d，21d，28d，2m，3m动物以水合氯醛(400mg/kg，ip)麻醉，4％多聚甲醛经心灌流固定，经石蜡包埋，切4μm厚切片进行he染色，显微镜下拍照观察；高倍镜(x 400)下拍摄各切片海马cal，ca2，ca3区域各三张照片。计数海马cal，ca2，ca3区各部位(整张照片上)细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，计算右侧海马单位长度锥体神经元个数，取平均数为神经元密度(neuronal density，no)。

13、本项目将设计具有负载csvd的多重影响生物炎症因子、可无损影像示踪的微纳米粒子，选择自发性高血压大鼠为基础模型，构建系列的散弹式脑微血管栓塞的实验动物模型，探索运用功能微米材料直接构建脑微血管栓塞的csvd动物模型的实验方法和参数标准，并借助多普勒血流仪、磁共振成像、同步辐射血管成像等方法评估该模型的血流动力学变化，包括血管形态学、脑血流量变化及脑实质病理改变，拟与所负载的csvd多重影响生物因子进行关联，从分子水平上更多地了解脑小血管疾病的发病机制。

14、总之，本项目创新性地引入生物相容性良好的、荧光显微与临床影像(ct/mri、超声等)多功能无损示踪特性、可负载csvd影响生物因子的微纳米载体，用于构建csvd实验小动物模型。该多功能微纳米载体不仅是构建csvd实验动物模型的试剂，而且更为重要的是评价、分析所建立的构建csvd实验小动物模型的高效、无损的探针，减少了辅助评价方法带领的无法控制的额外干扰，也会降低一定的研究成本。最为重要的是符合临床病理特征的csvd实验小动物模型建立，为广大研究者提供揭示脑小血管病发病机制、临床诊断和治疗标准提供了坚实的实验基础。