乳牙间充质干细胞保存液及其保存方法与流程

本发明涉及干细胞保存，特别是一种乳牙间充质干细胞保存液及其保存方法。

背景技术：

1、干细胞在无菌条件下从人体自身组织中取出，经过分离、纯化后在模拟生理条件下，在体外进行培养，使其不断分化增殖，保持良好的生长状态和增殖活力，然后注入体内进行治疗。目前，细胞治疗大多采用静脉滴注的方式进行：将体外培养好的细胞注射到不同规格的氯化钠注射液中，加入或不加入一定比例的人血白蛋白，将制备好的细胞悬液通过静脉滴注回输病患。

2、在临床应用中，因为临床使用单位不具备相应的细胞培养技术和高标准专业化的细胞制备实验室，所以需要在区域性中心实验室进行细胞制备，制备好的细胞经过一定时间和距离的运输送到临床单位应用。细胞在回输前需要一段运输保存时间，就要求在运输过程中采用合适的保存液来维持细胞的活率和生物学效力。

3、例如，中国公开专利cn103404509a，一种细胞保存液、其制备方法和应用，所述细胞保存液以100 毫升氯化钠注射液和/ 或复方氯化钠注射液计，其中含有维生素0.01 ～1 克、白蛋白0.1 ～ 10 克、糖类0.1 ～ 1 克、三磷酸腺苷和/ 或三磷酸腺苷二钠0.001～ 0.1克。本发明的细胞保存液在2-10℃的温度范围内保存细胞，在24 小时内很好地维持了细胞活率和生物学特性，避免了细胞复苏和再次洗涤的风险，也避免了现有保存方法引起的细胞死亡和生物学特性改变，极大地扩大了中心实验室细胞应用的地域覆盖范围。其中，维生素优选维生素c，说明书实施例13中记载，保存后再培养的细胞状态良好，死细胞较少，保存前后细胞形态无变化。

4、可知，现有的细胞保存液并不一定能够促进细胞向其他类型细胞的分化，目前间充质干细胞的运输方式的只注重于延长干细胞在运输过程中的活性，并无特异性针对提高乳牙干细胞潜在治疗效果的运输方式。

5、然而，研究发现乳牙间充质干细胞是从儿童乳牙组织中分离出来的间充质干细胞，它具有自我更新、多向分化的能力。而且少量的牙髓间充质干细胞能够通过分裂增殖获得更多的乳牙间充质干细胞。除了生成牙组织细胞，还能“变身”为其他类型细胞，如神经细胞、肌肉细胞、软骨细胞等，可以用于机体的组织修复。此前的体内研究表明，乳牙干细胞可重建功能性的牙本质/牙髓复合体以及其他组织，如骨头、牙骨质、血管和神经组织，并且经过广泛的研究，除了牙科疾病，乳牙干细胞对各种系统性疾病如脊髓损伤、帕金森氏症、拥有同样的医用价值。

6、乳牙间充质干细胞能够分化为如神经细胞、肌肉细胞、软骨细胞等，可以用于机体的组织修复。但促进乳牙间充质干细胞的分化培养大多是采用专门的体外培养基。例如中国公开专利cn 108753710 a中，记载了一种无血清完全培养基及其应用，包括依次或混合使用的以下两种培养基：其中，培养基i是在基础培养基中添加l-谷氨酰胺、1％-4％能有效促进细胞粘附和扩展的血清替代物，l-谷氨酰胺的浓度为2mm/l；培养基ii是在基础培养基中添加l-谷氨酰胺、7％-10％用于培养esc和ipsc的血清替代物，l-谷氨酰胺的浓度为2mm/l。本发明还提供了所述无血清完全养基在培养间充质干细胞中的应用。本发明所使用的培养基成分简单配制简便，提供的乳牙间充质干细胞培养方法有利于体外培养人乳牙间充质干细胞，维持干细胞的“干性”及多向分化能力。但是经过这样培养后的乳牙间充质干细胞也只能保持多向分化能力，不一定能够增强治疗神经痛的治疗效果，且仍旧需要在实验室内进行培养一定时间，才能与保存液混合，这样使得投入临床所需要的时间更长。

7、综上可知，现有的细胞保存液并不一定能够促进乳牙间充质干细胞向其他类型细胞的分化，如果细胞保存液既能够保持细胞活性，同时又能在细胞保存液的作用下诱导干细胞的分化，从而提高潜在治疗效果，那么保持较高活性的乳牙间充质干细胞就可以快速投入到临床治疗中，不需要再经过实验室培养基的培养。因此需要一种可以针对提高干细胞潜在治疗效果的间充质干细胞的保存液。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种乳牙间充质干细胞保存液及其保存方法。

2、本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种乳牙间充质干细胞保存液，包括有氯化钠注射液和甲钴胺注射液；还包括有人血蛋白、电解质注射液、分子肝素钙注射液和氨基酸注射液中的至少两种；

3、进一步的，按照重量份数，包括有90-100份的氯化钠注射液、0.1-1份的甲钴胺注射液、2-3份的人血蛋白、3-6份的电解质注射液；

4、进一步的，按照重量份数，包括有90-100份的氯化钠注射液、0.1-1份的甲钴胺注射液、2-3份的氨基酸注射液、3-6份的分子肝素钙注射液；

5、本发明还提供一种乳牙间充质干细胞保存方法，包括如下步骤，

6、1）配置上述的细胞保存液；

7、2）将乳牙间充质干细胞培养至p4代，消化离心；

8、3）使用步骤1）的保存液重悬步骤2）收集到的乳牙间充质干细胞；

9、进一步的，乳牙间充质干细胞在保存液中的密度为：2×106-8×107/ml；

10、进一步的，保存的时间为0-48h；保存的温度为0～28℃；

11、进一步的，该方法下保存的乳牙间充质干细胞用于神经类疾病的治疗；

12、更进一步的技术方案是该方法下保存的乳牙间充质干细胞用于大鼠三叉神经痛模型的治疗。

13、本发明具有以下优点：

14、1、0.9%氯化钠注射液与电解质注射液可以保持细胞的渗透压平衡，人血白蛋白、电解质注射液或氨基酸注射液、分子肝素钙注射液可以使细胞在运输过程中不聚团，从而保持细胞活性；经过保存8h后，细胞活率均在95%以上。

15、2、甲钴胺注射液为神经营养类注射液，易转移至细胞的细胞器，从而促进核酸和蛋白质的合成，并且经实验发现甲钴胺可诱导人乳牙干细胞向神经元样细胞特异性分化，进而提高乳牙干细胞对神经类疾病的潜在治疗效果；

16、3、模拟8小时的乳牙间充质干细胞运输后，将乳牙间充质干细胞用于大鼠三叉神经痛模型的治疗，在对比例提升了机械疼痛的阈值的情况下，本发明将机械疼痛的阈值进一步提升，增强了乳牙间充质干细胞对大鼠三叉神经痛的治疗效果；

17、4、本发明的乳牙间充质干细胞保存液既能够保持细胞活性，同时又能在细胞保存液的作用下诱导干细胞的分化，从而提高潜在治疗效果，保持较高活性的乳牙间充质干细胞可以快速投入到临床治疗中。

技术特征：

1.一种乳牙间充质干细胞保存液，其特征在于：包括有氯化钠注射液和甲钴胺注射液；还包括有人血蛋白、电解质注射液、分子肝素钙注射液和氨基酸注射液中的至少两种。

2.根据权利要求1所述的乳牙间充质干细胞保存液，其特征在于：按照重量份数，包括有90-100份的氯化钠注射液、0.1-1份的甲钴胺注射液、2-3份的人血蛋白、3-6份的电解质注射液。

3.根据权利要求1所述的乳牙间充质干细胞保存液，其特征在于：按照重量份数，包括有90-100份的氯化钠注射液、0.1-1份的甲钴胺注射液、2-3份的氨基酸注射液、3-6份的低分子肝素钙注射液。

4.一种乳牙间充质干细胞保存方法，其特征在于：包括如下步骤，

5.根据权利要求4所述的乳牙间充质干细胞保存方法，其特征在于：乳牙间充质干细胞在保存液中的密度为：2×106 -8×107 /ml。

6.根据权利要求4所述的乳牙间充质干细胞保存方法，其特征在于：保存的时间为0-48h；保存的温度为0～28℃。

7.根据权利要求4所述的乳牙间充质干细胞保存方法，其特征在于：该方法下保存的乳牙间充质干细胞用于神经类疾病的治疗。

8.根据权利要求7所述的乳牙间充质干细胞保存方法，其特征在于：该方法下保存的乳牙间充质干细胞用于大鼠三叉神经痛模型的治疗。

技术总结
本发明公开了一种乳牙间充质干细胞保存液，包括有氯化钠注射液和甲钴胺注射液；还包括有人血蛋白、电解质注射液、分子肝素钙注射液和氨基酸注射液中的至少两种；甲钴胺注射液为神经营养类注射液，易转移至细胞的细胞器，从而促进核酸和蛋白质的合成，并且经实验发现甲钴胺可诱导人乳牙干细胞向神经元样细胞特异性分化，进而提高乳牙干细胞对神经类疾病的潜在治疗效果。

技术研发人员：张学超,龙绍疆,段红梅
受保护的技术使用者：成都锦欣博悦生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12