一种利用人源化菌群构建孤独症小鼠模型的方法与流程

本发明涉及动物模型，具体涉及一种利用人源化菌群构建孤独症小鼠模型的方法。

背景技术：

1、儿童孤独症(autism spectrum disorder，asd)，是一种以社交沟通障碍、重复和刻板行为/狭窄兴趣为特征，具有高度临床和病因异质性的一类复杂的神经发育障碍性疾病，严重危害儿童健康。我国儿童asd发病率已达1％。目前的研究表明孤独症是遗传因素和环境因素共同导致，但是其机制并不明确，并且尚无特效药物，因此近年来受到广泛关注。

2、人体肠道微生物基因组作为人类的第二套基因组，与人类健康密切相关。肠道微生物是人体内最复杂和种群数量最多的微生物生态系统，无论是健康或者疾病状态下，人类的生理代谢特性都在时刻受到肠道菌群结构变化的影响。而肠道微生物组成和结构的变化也会影响宿主的健康。

3、目前孤独症的小鼠模型建立方法有很多种，并且取得了一定进展，但仍存在一些缺陷，如模型制备时间长、操作过于复杂、可重复性差、成本高等，都不利于广泛的推广。

4、人源化菌群小鼠为人类肠道菌群的研究提供了一个很好的体内模拟，它克服了人体实验的各种不确定性因素(如遗传、环境和饮食因素等)，能够直接通过小鼠模型直接研究肠道菌群和人类健康或疾病的因果关系，是人体微生物组和疾病研究的重要方法。目前，应用无菌小鼠建立人源化菌群小鼠模型是微生物组领域的重要策略。然而无菌动物需要十分严格的繁殖和饲养条件，极大增加了成本。在asd等神经发育障碍性疾病研究中，无菌小鼠也存在以下不足之处：gf小鼠的肠道发育和先天免疫缺陷，神经发育缺陷和行为表现异常，生命力差和繁殖力低，疾病建模后死亡率高。

5、因此，提供一种利用人源化菌群构建孤独症小鼠方法是本领域技术人员急需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明主要目的在于提供一种利用人源化菌群构建孤独症小鼠模型的方法，本发明所述方法可重复性强，成功率高，成本低，模型症状更典型，克服了现有技术的不足。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供一种利用人源化菌群构建孤独症小鼠模型的方法，所述方法包括以下步骤：

4、粪菌悬液的制备；

5、采用多联抗生素分阶段清除试验小鼠内肠道菌群；

6、向清除肠道菌群的雌性和雄性小鼠中移植粪菌悬液，合笼，孕鼠分娩后得到的子代鼠即为人源化菌群的孤独症模型鼠。

7、进一步地，粪菌悬液的制备方法为：

8、(1)粪便稀释液的配置：配置pbs缓冲液，向缓冲液内加入半胱氨酸、甘油；

9、(2)粪便稀释液灭菌处理；

10、(3)将来源于临床确诊为儿童孤独症患儿的粪便加入到灭菌后的粪便稀释液中，搅拌均匀后过滤得到粪菌悬液；

11、(4)将所得粪菌悬液转移至-80℃冰箱保存。

12、更进一步地，步骤(1)、(3)均在厌氧工作站内完成，其中厌氧环境要求o2浓度＜0.2％。

13、进一步地，采用多联抗生素分阶段清除试验小鼠内肠道菌群的方法为：

14、第一阶段，对试验小鼠采用灌服或饮水方式服用多联抗生素a；第二阶段，对试验小鼠采用灌服或饮水方式服用多联抗生素b；第三阶段，对试验小鼠采用灌服或饮水方式服用多联抗生素a；

15、多联抗生素a由美罗培南、硫酸新霉素、万古霉素盐酸盐组成；多联抗生素b由氨苄西林、头孢哌酮钠盐、克林霉素盐酸盐组成。

16、进一步地，向清除肠道菌群的雌性和雄性小鼠中采用灌胃方式移植粪菌悬液，粪菌悬液灌胃量为100～200μl/只/天，持续1周。

17、本发明还提供以上所述方法制备得到的孤独症小鼠模型。

18、与现有技术相比，本发明具有以下优势：

19、(1)本发明公开的方法通过对亲代小鼠的粪菌移植处理，在子代小鼠中成功构建出人源化菌群孤独症小鼠模型，成功率高，可重复性强，模型症状典型，具有实用性。

20、(2)本公开方法采用三阶段抗生素处理清除亲代小鼠肠道菌群，相较于无菌小鼠成本更低，不会造成亲代小鼠行为学改变，更实用于孤独症研究。

技术特征：

1.一种利用人源化菌群构建孤独症小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，粪菌悬液的制备方法为：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)、(3)均在厌氧工作站内完成，其中厌氧环境要求o2浓度＜0.2％。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中半胱氨酸浓度为0.05％～0.2％，甘油浓度为10～25％；步骤(3)中粪便稀释液、粪便体积重量比为1-6ml/g；步骤(3)中采用75-100μm的细胞筛过滤。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)处理总时长≤30min，处理结束后立即将所得粪菌悬液转移至-80℃冰箱保存。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用多联抗生素分阶段清除试验小鼠内肠道菌群的方法为：

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，各阶段将多联抗生素溶解于试验小鼠饮用水中，各类抗生素浓度为0.5～1.5mg/ml，处理至少7天。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述试验小鼠为spf级c57bl/6小鼠，鼠龄6-8周。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，向清除肠道菌群的雌性和雄性小鼠中采用灌胃方式移植粪菌悬液，粪菌悬液灌胃量为100～200μl/只/天，持续1周。

10.权利要求1-9任一项所述方法制备得到的孤独症小鼠模型。

技术总结
本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种利用人源化菌群构建孤独症小鼠模型的方法。所述方法包括以下步骤：粪菌悬液的制备；采用多联抗生素分阶段清除试验小鼠内肠道菌群；向清除肠道菌群的雌性和雄性小鼠移植粪菌悬液，合笼，孕鼠分娩后得到的子代鼠即为人源化菌群的孤独症模型鼠。本发明所述方法可重复性强，成功率高，成本低，模型症状更典型，克服了现有技术的不足。

技术研发人员：张磊,陈斌,王庆华,苏真真,姜莘,薛鑫鑫
受保护的技术使用者：张磊
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13