一种提高甜叶菊中甜菊糖苷含量的方法

本发明属于分子生物学，具体涉及一种提高甜叶菊中甜菊糖苷含量的方法。

背景技术：

1、甜叶菊(stevia rebaudiana bertoni)又名“甜菊”、“甜草”、“甜茶”等，是菊科斯台维亚属的一种小型多年生草本植物，原产于巴拉圭以及巴西等国家，我国于上世纪70年代引种成功，目前已成为世界上最大的甜叶菊生产国和出口国。甜菊糖苷是甜叶菊叶片中的主要活性成分(约占叶片干重的4％～20％)，主要包括甜菊苷(stevioside)、瑞鲍迪苷a(rebaudioside a)和瑞鲍迪苷c(rebaudioside c)。甜菊糖苷具有高甜度、低热量等特点，称为天然非营养型甜味剂。此外，还具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗肿瘤、治疗龋齿、调节免疫等多种药理活性，常用于健康饮料和其他食物的天然甜味添加剂。然而，甜菊糖苷合成的调控机制尚待阐明。

2、表观遗传是指在核酸序列未发生改变的情况下，遗传物质出现了可遗传的变化，从而导致可遗传的表型改变。表观遗传调控是一种普遍存在的基因表达调控方式，主要包括dna甲基化，组蛋白修饰(甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等)，染色质可及性和非编码rna调控等。其中，组蛋白乙酰化修饰是表观遗传中的一种重要修饰方式，由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,hat)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,hdac)催化。hdac是基因表达的负调控因子，通过将组蛋白和非组蛋白的赖氨酸残基去乙酰化抑制基因的表达。hdac抑制剂(hdac inhibitor，hdaci)通过与hdac结合抑制其催化活性，从而促进基因的转录表达。根据化合物结构的不同，hdaci主要分为苯酰胺类、氧肟酸盐、环肽类、短链脂肪酸类等。其中，烟酰胺(nicotinamide，nic)属于苯酰胺类抑制剂，nic抑制class iii型hdac。dna甲基化由dna甲基转移酶(dna methyltransferase)和dna去甲基化酶(dna demethylase)催化。5～氮胞苷(320～67～2；5～azacytidine)是一种重要的dna甲基化抑制剂，能够通过降低dna的甲基化水平来调节基因的表达，从而调控植物的生长发育等过程。

3、因此，通过探究组蛋白去乙酰化酶抑制剂对甜菊糖苷积累的影响，可以提供有效提高甜叶菊中甜菊糖苷含量的方法，为更好的开发甜叶菊的市场应用奠定一定的基础。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种提高甜菊糖苷的方法，能有效提高甜叶菊中甜菊糖苷的含量。

2、实现上述技术目的，包括以下技术方案。

3、本发明的第一方面，是一种制备甜菊糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：将甜叶菊种子苗在含有组蛋白去乙酰化酶抑制剂或dna甲基转移酶抑制剂的培养基中培养不少于7天，收集甜叶菊种子苗的地上部，提取甜菊糖苷，获得甜菊糖苷。

4、一种提高甜叶菊中甜菊糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：将甜叶菊种子苗在含有组蛋白去乙酰化酶抑制剂或dna甲基转移酶抑制剂的培养基中培养不少于7天。

5、在其中一些实施例中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为nic，所述dna甲基转移酶抑制剂为5～氮杂胞苷(5-azacytidine，5-azac)。

6、在其中一些实施例中，所述nic在培养体系中的浓度为0.5～2.5mm；

7、在其中一些实施例中，所述5～azac在培养体系中的浓度为15～60μm。

8、在其中一些实施例中，所述nic在培养体系中的浓度为1.0～2.0mm；5～azac在培养体系中的浓度为25～50μm。

9、在其中一些实施例中，所述nic在培养体系中的浓度为0.8～1.2mm，进一步优选为1.0mm和2.0mm；所述5～azac在培养体系中的浓度为22～35μm。，进一步优选为25μm和50μm。

10、在其中一些实施例中，所述培养时间为7-14天。

11、在其中一些实施例中，所述培养基为ms固体培养基，其包含以下浓度的组分：4.43±0.05g/l ms培养基、20±0.2g/l蔗糖、1.0±0.01g/l吗啉乙磺酸，ph5.8～6.0。

12、(2)按照料液比为18～22：1mg/ml向步骤(1)获得的样品中加入灭菌超纯水，55～65℃进行超声提取0.5～1.5小时，吸取上清液，过滤，得到甜菊糖苷

13、在其中一些实施例中，所述提取甜菊糖苷的方法包括以下步骤：

14、(1)将收集到的培养物的地上部用液氮研磨并冻干，获得样品；

15、(2)按照料液比为18～22：1mg/ml向步骤(1)获得的样品中加入灭菌超纯水，55～65℃进行超声提取0.5～1.5小时，吸取上清液，过滤，得到甜菊糖苷。

16、优选地，上述步骤(2)为：按照料液比为20：1mg/ml向步骤(1)获得的样品中加入灭菌超纯水，60℃进行超声提取1小时，吸取上清液，过滤，得到甜菊糖苷。

17、在其中一些实施例中，步骤(2)所述超声提取次数为1～2次，吸取上清液过滤后，合并滤液。

18、在其中一些实施例中，所述提取甜菊糖苷的方法还包括以下步骤：

19、(3)将步骤(2)蒸干浓度产物用灭菌超纯水重悬，过滤，收集滤液，得到甜菊糖苷。

20、本发明的另一方面，是提供组蛋白去乙酰化酶抑制剂或dna甲基转移酶抑制剂在提高植物的甜菊糖苷含量中的应用。

21、在其中一些实施例中，所述植物为甜叶菊。

22、在其中一些实施例中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为nic。

23、在其中一些实施例中，所述所述dna甲基转移酶抑制剂为5～azac。

24、在其中一些实施例中，所述nic在培养体系中的浓度为0.5～2.5mm；

25、在其中一些实施例中，所述5～azac在培养体系中的浓度为15～60μm。

26、在其中一些实施例中，所述nic在培养体系中的浓度为1.0～2.0mm。

27、优选地，所述nic的终浓度为0.8～1.2mm。

28、在其中一些实施例中，5～azac在培养体系中的浓度为25～50μm。

29、优选地，所述5～azac的终浓度为22～27μm。

30、本发明通过研究首次发现，使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂或dna甲基转移酶抑制剂处理甜叶菊种子苗，能有效提高甜叶菊中甜菊糖苷(包括甜菊苷(stevioside)、瑞鲍迪苷a(rebaudioside a)和瑞鲍迪苷c(rebaudioside c))的含量。本发明提供的方法具有简单、快速、高效和成本低等优点，在农业、医药等领域具有广阔的应用空间。

技术特征：

1.一种制备甜菊糖苷的方法，包括以下步骤：将甜叶菊种子苗在含有组蛋白去乙酰化酶抑制剂或dna甲基转移酶抑制剂的培养基中培养不少于7天，收集甜叶菊种子苗的地上部，提取甜菊糖苷，获得甜菊糖苷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为烟酰胺，和/或所述dna甲基转移酶抑制剂包括5～氮杂胞苷。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述烟酰胺在培养体系中的浓度为0.5～2.5μm，优选为1.0～2.0mm。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，5～氮杂胞苷在培养体系中的浓度为15～60μm，优选为25～50μm。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述培养时间为7～14天。

6.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基为ms固体培养基，其包含以下浓度的组分：4.43±0.05g/l ms培养基、1.0±0.01g/l吗啉乙磺酸、20±0.2g/l蔗糖、ph＝5.8～6.0。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取甜菊糖苷的方法包括以下步骤：

8.组蛋白去乙酰化酶抑制剂或dna甲基转移酶抑制剂在提高甜叶菊的甜菊糖苷含量中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为烟酰胺，和/或所述dna甲基转移酶抑制剂为5～氮杂胞苷。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述烟酰胺在培养体系中的浓度为0.5～2.5μm，优选为1.0～2.0mm；和/或5～氮杂胞苷在培养体系中的浓度为15～60μm，优选为25～50μm。

技术总结
本发明提供了一种制备甜菊糖苷含量的方法，包括以下步骤：将甜叶菊种子苗置于含组蛋白去乙酰化酶抑制剂或DNA甲基化抑制剂的培养基中培养，收集培养物的地上部，提取甜菊糖苷。本发明还提供了含组蛋白去乙酰化酶抑制剂或DNA甲基化抑制剂在提高甜叶菊的甜菊糖苷含量中的应用。本发明使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理甜叶菊种子苗，能有效提高甜叶菊中甜菊糖苷的含量。本发明提供的方法具有简单、快速、高效和成本低等优点，在农业、食品和医药等领域具有广阔的应用空间。

技术研发人员：罗鸣,李玉萍,邱源
受保护的技术使用者：中国科学院华南植物园
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12