小果甜柿组培快繁方法

本发明属于植物栽培领域，具体涉及小果甜柿组培快繁方法。

背景技术：

1、栽培柿主要通过嫁接繁殖，完全甜柿成熟后即可脆食。目前我国柿砧木主要有君迁子、油柿、野柿、美洲柿、浙江柿(罗正荣和王仁梓，2001)。使用最广泛的砧木君迁子与目前主栽甜柿优质品种“富有”系嫁接出现不亲和，成为限制甜柿发展的重要因素。

2、近年来，研究发现“小果甜柿”与主推“富有”系品种嫁接亲和力强，在甜柿栽培推广中具重要价值。华中农业大学柿研究团队从湖北省大别山区收集到完全甜柿广亲和砧木小果甜柿和牛眼柿等新基因型，并通过离体嫁接亲和性鉴定、愈伤组织靠接实验及6年生砧穗复合体的田间表现调查发现小果甜柿与“次郎”、“太秋”、“富有”系甜柿嫁接亲和(胡梦珏，陈莉，刘一凤，张青林，罗正荣.2017.“小果甜柿”和“牛眼柿”作为完全甜柿砧木的应用潜力研究.果树学报，34(1):50-58.)。目前小果甜柿作为广亲和砧木，其繁殖方式主要通过种子播种，这种常规方法繁育的柿砧木苗木成品需要的时间长，后代因染色体重组容易发生变异和性状分离，苗木的一致度不高，管理繁琐；柿离体培养可解决这一问题。

3、但柿在组培过程中被普遍认为存在难生根的问题，成为柿种苗商业生产的一大阻碍。造成柿组培苗生根率不同的影响因素有多种，如品种类型，培养基种类，激素种类、处理时间和处理方法，组培苗继代次数等；其中柿的组织培养是存在品种差异性的。tao等以来源于16个品种的愈伤组织为试材检测了品种基因型对不定芽形成的影响，发现来源于不同品种的愈伤组织，其颜色等外观状况有很大差别，16个品种中只有8个能形成不定芽且不定芽形成百分率从2％到72％不等，推测其原因可能是不同品种的增殖能力不同，也有可能是试验中使用了同一种培养基而不同品种对培养基的需求却不同。此外murayama等采用相同的方法对5个甜柿品种进行生根培养，所得生根率也有很大差异，从8％～96％不等，再次证明了柿组培过程中品种差异的存在。目前缺乏高效与规模化小果甜柿砧木繁殖技术体系，也没有有关小果甜柿的离体再生完整个体的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种小果甜柿组培快繁方法，解决现有技术中小果甜柿通过种子繁殖带来的柿砧木苗木成品时间长、变异多且采用离体培养时难生根的技术问题。

2、为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种小果甜柿组培快繁方法：

3、包括以下步骤：

4、(1)初代培养：取带芽茎段进行灭菌和消毒，剥除饱满休眠芽外部数层鳞片，接种在初代培养基中，培养得到初代组培苗；

5、(2)增殖培养：将初代组培苗剪成茎段，接种在含甜菜碱增殖培养基中培养，获得无根组培苗；

6、(3)生根培养：将无根组培苗采用浸蘸生根法或两步生根法进行生根培养，得到生根组培苗；其中，浸蘸生根法中采用的第一植物生长调节剂为naa或iba；两步生根法中采用的第二植物生长调节剂为naa、iba和mt的混合物；

7、(4)驯化移栽：取生根组培苗先闭瓶炼苗后开盖炼苗，移栽至育苗穴盘培养至成活，进而移栽至大田。

8、进一步地，步骤(1)中，带芽茎段是在冬季采集生长健壮、芽饱满的枝条剪成的；所述灭菌是将带芽茎段用吐温-20浸洗1～2min后用无菌水冲洗干净；所述消毒是将灭菌后的带芽茎段先在75％的酒精溶液中浸泡25～35s，再在0.5～1.2％的次氯酸钠溶液中消毒5～7min后无菌水冲洗干净。

9、进一步地，步骤(1)中，剥除饱满休眠芽外部2～3层鳞片后接种在初代培养基中；所述初代培养基由ms(1/2n)+1mg/l的zt+0.1mg/l的iaa+30mg/l蔗糖+7g/l琼脂+0.6g/l的pvp-40组成的；初代培养的培养条件是在25±2℃、光照强度1000～3000lx和光照时间为16h/d的组培室中培养，培养时间为30～60d。

10、进一步地，步骤(2)中，初代组培苗剪成1～1.5cm的茎段。

11、进一步地，步骤(2)中，含甜菜碱增殖培养基由dkw+1mg/l zt+0.1mg/l iaa+30mg/l蔗糖+7g/l琼脂+0.6g/l的pvp-40+100～1000μmol/l的甜菜碱组成；增殖培养的培养条件与初代培养的培养条件相同，培养时间为30～60d。

12、进一步地，步骤(3)中，浸蘸生根法是先用第一植物生长调节剂浸泡无根组培苗的基部，再进行暗处理5～15d后，转入基本培养基a中进行生根培养30～50d；第一植物生长调节剂为naa时，浓度为50～200mg/l，浸泡时间为5～15min；第一植物生长调节剂为iba时，浓度为100～200mg/l，浸泡时间为5～10min。所述基本培养基a是由1/2ms+1mg/l活性炭+30mg/l蔗糖+7g/l琼脂+0.6g/l pvp-40组成的。

13、进一步地，步骤(3)中，两步生根法是先将无根组培苗接种至基本培养基b中，进行暗处理5～15d后，转入基本培养基a中进行生根培养30～50d；所述基本培养基b是由基本培养基a+0.5～1mg/l的naa+0.2～1.5mg/l的iba+0.1～5mg/l的mt组成。

14、进一步地，步骤(4)中，闭瓶炼苗时间为3～10d，开盖炼苗时间为2～4d。

15、进一步地，步骤(4)中，移栽至育苗穴盘的栽培基质采用育苗基质与蛭石的混合土，栽培前用1000倍多菌灵进行拌土；移栽至育苗穴盘后，用透气保温盖盖上，在托盘中加入水；每7d喷施1000倍多菌灵溶液，放在温度为23～25℃自然光照条件下培养至成活。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

17、本发明通过初代培养和增殖培养获得无根组培苗，通过在增殖培养中添加甜菜碱，提高小果甜柿的增殖效率；通过第一植物生长调节剂进行的浸蘸生根法或第二植物生长调节剂进行的两步生根法，能够诱导生根，且促进植株根部粗壮，利于提高存活率；最后通过采用闭瓶炼苗和开盖炼苗配合，成功驯化小果甜柿组培苗，构建了完整的柿离体培养繁殖体系；相对种子播种的繁殖方式，本发明能够有效缩短柿砧木苗木成品时间，且解决了传统柿离体再生难生根的问题，所得后代苗木的一致度高，建立高效的“小果甜柿”离体快速繁殖技术体系，为我国优质甜柿产业的可持续发展提供技术支持。

技术特征：

1.一种小果甜柿组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的小果甜柿组培快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，带芽茎段是在冬季采集生长健壮、芽饱满的枝条剪成的；所述灭菌是将带芽茎段用吐温-20浸洗1～2min后用无菌水冲洗干净；所述消毒是将灭菌后的带芽茎段先在75％的酒精溶液中浸泡25～35s，再在0.5～1.2％的次氯酸钠溶液中消毒5～7min后冲洗干净。

3.根据权利要求1所述的小果甜柿组培快繁方法，其特征在于，步骤(1)中，剥除饱满休眠芽外部2～3层鳞片后接种在初代培养基中；所述初代培养基由ms(1/2n)+1mg/l的zt+0.1mg/l的iaa+30mg/l蔗糖+7g/l琼脂+0.6g/l的pvp-40组成的；初代培养的培养条件是在25±2℃、光照强度1000～3000lx和光照时间为16h/d的组培室中培养，培养时间为30～60d。

4.根据权利要求1所述的小果甜柿组培快繁方法，其特征在于，步骤(2)中，初代组培苗剪成1～1.5cm的茎段。

5.根据权利要求1所述的小果甜柿组培快繁方法，其特征在于，步骤(2)中，甜菜碱增殖培养基由dkw+1mg/l zt+0.1mg/l iaa+30mg/l蔗糖+7g/l琼脂+0.6g/l的pvp-40+100～1000μmol/l的甜菜碱组成；增殖培养的培养条件与初代培养的培养条件相同，培养时间为30～60d。

6.根据权利要求1所述的小果甜柿组培快繁方法，其特征在于，步骤(3)中，浸蘸生根法是先用第一植物生长调节剂浸泡无根组培苗的基部，再进行暗处理5～15d后，转入基本培养基a中进行生根培养30～50d；第一植物生长调节剂为naa时，浓度为50～200mg/l，浸泡时间为5～15min；第一植物生长调节剂为iba时，浓度为100～200mg/l，浸泡时间为5～10min。

7.根据权利要求6所述的小果甜柿组培快繁方法，其特征在于，基本培养基a是由1/2ms+1mg/l活性炭+30mg/l蔗糖+7g/l琼脂+0.6g/lpvp-40组成的。

8.根据权利要求1所述的小果甜柿组培快繁方法，其特征在于，步骤(3)中，两步生根法是先将无根组培苗接种至基本培养基b中，进行暗处理5～15d后，转入基本培养基a中进行生根培养30～50d；所述基本培养基b是由基本培养基a+0.5～1mg/l的naa+0.2～1.5mg/l的iba+0.1～5mg/l的mt组成。

9.根据权利要求1所述的小果甜柿组培快繁方法，其特征在于，步骤(4)中，闭瓶炼苗时间为3～10d，开盖练苗时间为2～4d。

10.根据权利要求1所述的小果甜柿组培快繁方法，其特征在于，步骤(4)中，移栽至育苗穴盘的栽培基质采用育苗基质与蛭石的混合土，栽培前用1000倍多菌灵进行拌土；移栽至育苗穴盘后，用透气保温盖盖上，在托盘中加入水；每7d喷施1000倍多菌灵溶液，放在温度为23～25℃自然光照条件下培养至成活。

技术总结
本发明涉及小果甜柿组培快繁方法，包括以下步骤：初代培养：取带芽茎段进行灭菌和消毒，剥除饱满休眠芽外部数层鳞片，接种在初代培养基中，培养得到初代组培苗；增殖培养：将初代组培苗剪成茎段，接种在含甜菜碱增殖培养基中培养，获得无根组培苗；生根培养：将无根组培苗采用浸蘸生根法或两步生根法进行生根培养，得到生根组培苗；其中，浸蘸生根法中采用的第一植物生长调节剂为NAA或IBA；两步生根法中采用的第二植物生长调节剂为NAA、IBA和MT的混合物；驯化移栽：取生根组培苗先闭瓶炼苗后开盖炼苗，移栽至育苗穴盘培养至成活，进而移栽至大田。本发明能够有效缩短柿砧木苗木成品时间，且解决了传统柿离体再生过程生根困难的问题。

技术研发人员：张青林,刘彬,罗正荣,陈文兴,郭大勇,徐莉清
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13