一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法

本发明涉及植物组织培养，特别涉及一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法。

背景技术：

1、小花灯心草(juncus articulatus linn.2n＝80)是灯心草科(juncaceae)灯心草属(juncus)的多年生草本植物，在我国的山东、江苏、浙江、安徽、江西、湖南、湖北、福建、贵州、四川、广东、广西、云南、海南、西藏、台湾等地区均有分布[1]，在亚洲北部、欧洲、北美洲及非洲也有分布。作为一种湿生植物，小花灯心草主要生于海拔1200-3680m的溪边、水边、湿地、沼泽、湿地、疏林草地及稻田旁，但在不同生境中，形态特征存在较大变异。

2、灯心草属在我国共有属植物77种，10变种以及1亚种，多数属于纤维植物，可用于园林绿化，可作为牲畜饲草，少数还可供药用，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、催眠镇静等多种药理作用，具有较好的药品开发前景。小花灯心草根系发达，具有很强的抗污能力，能够在富营养化、重金属污染水体中正常生长，可以大量吸收水中过剩的氮、磷和钾等营养盐用于自身生长，还能有效地吸附富集铜、铅、镉等重金属，具有较好的去除效果。

3、小花灯心草是黑河中游盐碱化沼泽的植被之一。随着植物生态修复和人工湿地技术的发展应用，常被作为湿地的观赏绿植，应用于人工湿地生态系统中，同时发挥观赏和水质净化、重金属污水吸附处理的重要作用。小花灯心草作为湿生植物根系发达，叶片绿色筒状，是研究植物生态修复和禾本科单面叶发育形态发生的重要材料。

4、目前，国内外对灯心草属植物的研究较少，且主要集中在药用价值考证、重金属积累的生理特性和单面叶发育形态发生等方面，关于灯心草属植物组织培养的研究尚未见报道，更未有小花灯心草组织培养再生体系建立的报道。

技术实现思路

1、本发明针对小花灯心草的植物组织培养再生体系建立，以小花灯心草的成熟种子为外植体，比较分析了不同灭菌方式、外植体类型、培养基及植物生长调节剂对愈伤组织诱导、分化和植株再生的影响，提供了一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，建立并优化了小花灯心草的组织培养再生体系。

2、一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，包括如下步骤：

3、s1：外植体消毒；

4、s2：诱导愈伤组织的外植体筛选；

5、s3：愈伤组织诱导分化培养基筛选；

6、s4：愈伤组织再生培养基筛选；

7、s5：愈伤组织种类和继代时间筛选。

8、在上述技术方案基础上，所述步骤s1中将小花灯心草种子进行消毒处理，消毒处理的方法为a 30％ naclo消毒15-30min或方法b 75％乙醇消毒30s，10％-30％ naclo消毒15-30min中的任意一种。

9、在上述技术方案基础上，所述步骤s1在种子消毒处理前使用4％烟熏液进行种子破除休眠处理，提高出愈伤率，缩短诱导愈伤组织的时间。

10、在上述技术方案基础上，所述步骤s2中，诱导愈伤组织使用的外植体为s1处理得到的种子或s1处理得到的种子经培养所得的无菌幼苗的胚根和根尖。

11、在上述技术方案基础上，所述步骤s3中愈伤组织诱导培养基为以下浓度的组分：ms+2,4-d 2.0-5.0mg/l+6-ba 0.6mg/l，得到三类愈伤组织。

12、在上述技术方案基础上，所述三类愈伤组织，ⅰ类为黄色颗粒且硬实度高、ⅱ类黄色颗粒但松软、ⅲ类白色或略褐色且松软。

13、在上述技术方案基础上，所述步骤s4中愈伤组织再生培养基为以下浓度的组分：ms+kt 1.0-2.0mg/l+naa 0-2.0mg/l，再生培养4-5周，得到不定芽。

14、在上述技术方案基础上，所述步骤s5中继代ⅰ类愈伤组织，再生率90％以上。

15、在上述技术方案基础上，所述步骤s5中愈伤组织每4周继代一次，继代培养4-36周的愈伤组织均可最为再生/遗传转化的材料。

16、在上述技术方案基础上，s4中再生培养和s5中继代培养的条件如下：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5500-8000lux，恒温28℃。

17、本发明具有如下优点：

18、本发明通过优化小花灯心草诱导、分化、再生不同阶段的条件，首次成功建立了采用成熟种子和无菌苗产生的胚根和根尖两种外植体的小花灯心草高效稳定的再生体系。高效、快速的组培再生体系的建立，为小花灯心草的种质资源的创新研究和功能基因的调控机理研究奠定了坚实的基础。

技术特征：

1.一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤s1中将小花灯心草种子进行消毒处理，消毒处理的方法为a 30％naclo消毒15-30min或方法b 75％乙醇消毒30s，10％-30％naclo消毒15-30min中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤s1在种子消毒处理前使用4％烟熏液进行种子破除休眠处理。

4.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤s2中，诱导愈伤组织使用的外植体为s1处理得到的种子或s1处理得到的种子经培养所得的无菌幼苗的胚根和根尖。

5.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤s3中愈伤组织诱导培养基为以下浓度的组分：ms+2,4-d 2.0-5.0mg/l+6-ba0.6mg/l，得到三类愈伤组织。

6.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述三类愈伤组织，ⅰ类为黄色颗粒且硬实度高、ⅱ类黄色颗粒但松软、ⅲ类白色或略褐色且松软。

7.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤s4中愈伤组织再生培养基为以下浓度的组分：ms+kt 1.0-2.0mg/l+naa 0-2.0mg/l，再生培养4-5周，得到不定芽。

8.根据权利要求1和5所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤s5中继代ⅰ类愈伤组织，再生率90％以上。

9.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤s5中愈伤组织每4周继代一次，继代培养4-36周的愈伤组织均可最为再生/遗传转化的材料。

10.根据权利要求7-9中任一所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，s4中再生培养和s5中继代培养的条件如下：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5500-8000lux，恒温28℃。

技术总结
本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，包括如下步骤：S1：外植体消毒；S2：诱导愈伤组织的外植体筛选；S3：愈伤组织诱导分化培养基筛选；S4：愈伤组织再生培养基筛选；S5：愈伤组织种类和继代时间筛选。本发明通过优化小花灯心草诱导、分化、再生不同阶段的条件，首次成功建立了采用成熟种子和无菌苗产生的胚根和根尖两种外植体的小花灯心草高效稳定的再生体系。高效、快速的组培再生体系的建立，为小花灯心草的种质资源的创新研究和功能基因的调控机理研究奠定了坚实的基础。

技术研发人员：吴雪莉,王增裕,孙娟,杨国锋,熊王丹,姜凯,胡晓辰,卢文杰
受保护的技术使用者：青岛农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13