一种超雄草鱼的高效制备和检测方法及应用

本发明涉及水产动物遗传育种，具体涉及一种超雄草鱼的高效制备和检测方法及应用，采用该方法可以培育和快速筛选出yy型染色体的超雄草鱼。

背景技术：

1、雄核发育是指遗传失活的卵子与精子受精，产生的后代仅含有父本遗传物质的繁殖方式。目前还没有鱼类天然雄核发育的报道，但可以通过人工诱导实现，通常做法是使用紫外线、x射线、γ射线等物理方法处理卵子，使其失活后参与受精，然后在适当时间通过冷、热、高压等处理使精核的染色体加倍，进而发育成为完全是父本性状的二倍体。由于雄核发育个体高度纯合，不仅能够产生超级雄性和单性后代还可用于快速建立纯系、判别性别决定机制、保护濒危物种等，因而对其的研究具有十分重要的意义。

2、然而，与人工诱导的雌核发育相比，人工诱导的雄核发育个体生存率更低，目前雄核发育在植物育种中应用较多，制备超雄鱼类通常需要在胚胎发育期进行冷、热或高压处理，但处理开始的时间并不确定，难于摸索出一个精确的起始时间。水产动物中在鱼类有少量研究，目前进行过雄核发育研究的鱼类包括虹鳟、泥鳅、鲤、尼罗罗非鱼等。

3、由于人工失活卵核染色体的处理并非百分之百成功，因此必须有证据证明卵核对胚胎确实没有提供遗传物质，这就牵涉到如何鉴定雄核发育二倍体与正常受精而产生的二倍体问题。早期用到的鉴定方法有形态学遗传标记、染色体组型分析、同工酶分析等，但大多复杂且无法进行准确鉴定。随着分子生物学的发展，出现了dna指纹、rapd标记等分子技术手段，可以分析雄核发育的雌雄亲本及子代的dna标记，查明子代遗传物质的来源，是雄核发育中更为准确的分析方法。国内外的一些研究通过rapd等分子生物学技术来验证雄核发育途径的正确性，而反过来相应的方法也可以用来进行雄核发育个体的鉴定，比如目前热门的snp、indel标记等。hrm(高分辨熔解曲线)分析技术是近年兴起的一种新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的pcr技术，hrm无需序列特异性探针，在pcr结束后直接运行高分辨熔解，具有高灵敏度、高通量、低成本等优点。但hrm也同时对pcr产物长度要求很高(＜100bp)，为保障良好的分辨率，100bp内差异碱基数量需≥8个。目前已开发的草鱼性别分子标记，仅含零星的snp标记，且距离较远，并不适合hrm分析技术。

4、本发明中，我们将草鱼卵子进行紫外照射失活后，与草鱼精子授精，在发育6-36min的任意一个时间点中，都可以将受精卵取出进行冷激处理后，再转移至孵化桶中孵化，获得超雄草鱼。同时申请人还将草鱼雌性和雄性基因组进行精细比对，发掘出一个适用于hrm分析技术的草鱼x/y染色体特异性标记，利用此标记对上述雄核发育的草鱼进行鉴定，可成功分辨出xx，xy和yy型超雄草鱼。

5、本发明不仅能够产生超级雄性草鱼和单性后代快速建立草鱼纯系，还可判别草鱼性别决定机制，用于草鱼的性别决定与分化等基础研究。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种超雄草鱼的高效制备和检测方法，方法简单，便捷，快速。

2、本发明的另一个目的在于提供了一种超雄草鱼的高效制备和检测方法的应用。

3、为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

4、一种超雄草鱼的高效制备和检测方法，包括下述步骤：

5、将草鱼卵灭活后与草鱼精子孵育受精，再转移至25℃水体中进行发育，在发育期间的6-36min任何一个时间点，将受精卵进行冷激处理后进行孵化，孵化后，采用引物ciyspe-f:ggagagactgacaggtgtgtgac和ciyspe-r:cccccaacgctcggaggt对鱼苗进行hrm分型检测。

6、以上所述的方法中，优选的，发育期的时间范围为6-26min；

7、以上所述的方法中，优选的，冷激所用的方式为4-6℃水浴中处理8-16min；

8、以上所述的方法中，更好的，冷激所述的方式为4℃水浴中处理12min；

9、以上所述的方法中，优选的，孵化的水温为22-28℃，最佳为25℃。

10、本发明的保护内容还包括：上述方法在超雄草鱼育种中的应用；上述方法制备的超雄草鱼在建立草鱼纯系中的应用。

11、本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

12、目前还没有制备yy超雄草鱼并鉴别的成功技术，制备超雄鱼类通常需要在胚胎发育期进行冷、热或高压处理，但处理开始的时间并不确定，难于摸索出一个精确的起始时间。本发明不需要明确草鱼受精卵冷激起始的时间，仅需在受精后6-36min的时间内的任意一个时间点，对胚胎进行水浴冷激处理，即可诱导获得超雄草鱼。

13、此外，为了利用hrm技术快速对草鱼的性别进行鉴定，本发明在获得雄核发育yy草鱼的同时，还筛选获得一个草鱼x/y染色体特异性标记，该标记包括了3个snp位点，和1个indel位点，适合hrm技术的检测，可快速对获得的草鱼进行性别鉴定，精准分辨xx、xy和yy三种染色体类型。检测可在96孔板完成，一天即可完成10块96孔板，也就是960个样品的检测。因此本发明中yy超雄个体检测效率高，且通量大，极大地缩短了检测周期，并减少了后续测交验证所导致的成本。

技术特征：

1.一种超雄草鱼的高效制备和检测方法，包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发育期的时间范围为6-26min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：冷激所用的方式为4-6℃水浴中处理8-16min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：冷激所述的方式为4℃水浴中处理12min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：孵化的水温为22-28℃。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：孵化的水温为25℃。

7.权利要求1所述的方法在超雄草鱼育种中的应用。

8.上权利要求1所述的方法在建立草鱼纯系中的应用。

技术总结
本发明属于水产动物遗传育种技术领域，公开了一种超雄草鱼的高效制备和检测方法及应用，采用该方法可以培育出YY型染色体的超雄草鱼，同时利用本发明开发分子标记进行了快速的HRM分型。本发明提供的方法培育出的YY超雄草鱼可以应用于草鱼育种过程中种质快速纯化，也可应用于草鱼的性别决定与分化等基础研究。

技术研发人员：黄容,李勇明,桂彬,杨诚,黎阳雨,廖兰杰,汪亚平
受保护的技术使用者：中国科学院水生生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14