小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法与流程

本发明属于植物培养，具体是小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法。

背景技术：

1、小叶红叶藤[rourea microphylla(hook.et arn)planch)]，牛栓藤科红叶藤属植物，攀援灌木，多分枝，高1～4m，产于福建、广东、广西、云南等省区，生长于海拔100～600m的山坡或疏林中。小叶红叶藤具有观赏价值，其鲜红色的嫩叶和果实具有非常好的景观效果，可用于营建彩篱、孤植木、园景点缀等景观；此外，小叶红叶藤也是一种民间药，其茎叶可用于清热解毒、消肿解痛、止血，主治跌打肿痛和外伤出血等；另外，该植物具有特殊的芳香气味，在广西壮族地区常用作清热解毒、美容养颜和延年益寿的天然保健茶饮品。

2、小叶红叶藤主要以野生为主，少有人工种植，为了更好地利用和开发此品种，快速大量地进行人工栽培，需采用组织培养的方式进行驯化和繁殖；植物组织培养育苗繁殖周期短、效率高，不受季节和气候限制，可保持亲本的优良性状，且具有生长整齐标准等优点；通过植物组织培养对小叶红叶藤进行推广种植，利于园林景观中彩化品种选择及药材的采集；目前在对小叶红叶藤进行组织培养时，小叶红叶藤的生根率和存活率均不高；因此，有必要提出一种小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法，以野生小叶红叶藤种子为外植体，通过种胚消毒灭菌、扩繁、生根和移栽，用以提高小叶红叶藤进行组织培养时生根率和存活率，为其苗木的规模化生产提供参考依据。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法，包括以下步骤：

3、s1：种子及种胚消毒灭菌；采摘6～8成成熟的野生小叶红叶藤果实，将其处理分成种子和种胚两部分，分别对种子和种胚进行外植体的消毒灭菌；s2：扩繁；消毒灭菌后，分别将种子和种胚接种于添加了6-ba、naa和无外源激素的ms始芽及继代培养基中，观察始芽诱导及2～3个芽苗的芽苗不定芽分化和生长情况；s3：生根；分别挑选出顶芽叶片舒展、叶色翠绿且色带明显、生长健壮和高3～4cm的单芽和丛芽并接种于生根培养基中；s4：移栽，选用泥炭土和黄心土，将其按体积为1∶5的比例搅拌均匀，将单芽和丛芽分别移栽至育苗杯中培育，移栽2个月后统计成活率。

4、进一步，s1中，消毒灭菌的方式为：先在烧杯内使用清水对种子和种胚漂洗5～10min，漂洗过程中用玻璃棒不断搅拌使种子和种胚充分洗净，漂洗完毕采用纱布封好烧杯口，置于流水下冲洗1h，用滤纸将种子和种胚吸干水分备用；将带种皮的种子和去掉种皮及假种皮的种胚分别放入不同消毒剂中消毒，消毒后进行接种，每种消毒剂均接种20瓶，每瓶接种1粒种子和种胚中的一种，培养15d后观察统计污染情况。

5、进一步，消毒剂可选用1‰hgcl2溶液和75％酒精。

6、进一步，s2中，为诱导出不定芽，抽芽后，将抽芽剪至2～3cm的单芽，接种于添加了6-ba和naa的ms增殖培养基中，每处理接种30瓶，每瓶接种单芽5个，3个重复，培养30d。

7、进一步，s2中，为防止芽苗在培养过程中出现黄化、落叶和枯死现象，在增殖培养基中添加酸水解酪蛋白20～100mg/l、防落素5～15mg/l、vc 10～20mg/l和核黄素10～20mg/l，分别进行不同浓度的试验，每处理均接种30瓶，每瓶均接种丛芽4个，3个重复，培养30d。

8、进一步，s3中，生根培养基以1/3ms为基本培养基，添加不同浓度的naa、iaa和iba，采用正交设计l9进行试验，每种处理均20瓶，每瓶均9株，3次重复，培养40d。

9、进一步，naa的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/l；iaa的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/l；iba的浓度分为1.0、1.5和2.0mg/l。

10、进一步，育苗杯内部中空且顶部开设有开口，育苗杯底部的两侧均呈斜面。

11、进一步，小叶红叶藤的植株可用做园林景观，小叶红叶藤的茎叶可用做制备保健茶饮品的原材料。

12、采用上述方案后实现了以下有益效果：

13、本发明以野生小叶红叶藤种子为外植体，通过种胚消毒灭菌、扩繁、生根和移栽，提高小叶红叶藤进行组织培养时生根率和存活率，为其苗木的规模化生产提供参考依据；本发明中野生小叶红叶藤种子无菌率可高至100％，其胚芽已发育完全，在接种后第7～13天开始抽芽，生长良好；将剪下的芽苗接种在含外源激素6-ba 0.8mg/l和naa 0.3mg/l的增殖培养基中，可分化出的不定芽多且健壮。

14、本发明在培养基中添加ch 100mg/l、防落素15mg/l、vc 20mg/l及核黄素20mg/l，可有效地改善芽苗生长情况，使丛芽健壮和枝繁叶茂；ch是多种氨基酸的混合物，对胚状体和不定芽的分化有良好的促进作用，加快了芽苗体内的新陈代谢；vc是植物组织内广泛存在的高丰度小分子物质,具有延缓植物细胞衰老的作用；核黄素是酶辅因子黄素单核苷酸fmn和黄素腺嘌呤二核苷酸fad的直接前体，广泛参与植物代谢中的氢、氧与电子传递反应，发挥着不可或缺的作用。

15、本发明中小叶红叶藤丛芽在添加naa 1.0mg/l、iaa1.5 mg/l及iba1.0 mg/l的改良ms生根培养基中，生根率可达97.59％，且根系健壮，适合在育苗杯中移栽，移栽成活率可达95％。

16、在使用育苗杯时，可以通过开口向育苗杯内放入芽苗，可以根据芽苗的长势通过育苗杯底部的斜面对育苗杯进行多角度的放置，便于育苗杯内的芽苗多角度的进行光合作用。

技术特征：

1.小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：s1中，消毒灭菌的方式为：先在烧杯内使用清水对种子和种胚漂洗5～10min，漂洗过程中用玻璃棒不断搅拌使种子和种胚充分洗净，漂洗完毕采用纱布封好烧杯口，置于流水下冲洗1h，用滤纸将种子和种胚吸干水分备用；将带种皮的种子和去掉种皮及假种皮的种胚分别放入不同消毒剂中消毒，消毒后进行接种，每种消毒剂均接种20瓶，每瓶接种1粒种子和种胚中的一种，培养15d后观察统计污染情况。

3.根据权利要求2所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：消毒剂可选用1‰hgcl2溶液和75％酒精。

4.根据权利要求3所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：s2中，为诱导出不定芽，抽芽后，将抽芽剪至2～3cm的单芽，接种于添加了6-ba和naa的ms增殖培养基中，每处理接种30瓶，每瓶接种单芽5个，3个重复，培养30d。

5.根据权利要求4所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：s2中，为防止芽苗在培养过程中出现黄化、落叶和枯死现象，在增殖培养基中添加酸水解酪蛋白20～100mg/l、防落素5～15mg/l、vc10～20mg/l和核黄素10～20mg/l，分别进行不同浓度的试验，每处理均接种30瓶，每瓶均接种丛芽4个，3个重复，培养30d。

6.根据权利要求5所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：s3中，生根培养基以1/3ms为基本培养基，添加不同浓度的naa、iaa和iba，采用正交设计l9进行试验，每种处理均20瓶，每瓶均9株，3次重复，培养40d。

7.根据权利要求6所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：naa的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/l；iaa的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/l；iba的浓度分为1.0、1.5和2.0mg/l。

8.根据权利要求7所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：育苗杯内部中空且顶部开设有开口，育苗杯底部的两侧均呈斜面。

9.小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用，其特征在于：根据权利要求1-8的方法所繁殖的小叶红叶藤种子与种胚组织，小叶红叶藤的植株可用做园林景观，小叶红叶藤的茎叶可用做制备保健茶饮品的原材料。

技术总结
本发明公开了植物培养技术领域的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法，包括以下步骤：S1：种子及种胚消毒灭菌；采摘6～8成成熟的野生小叶红叶藤果实，将其处理分成种子和种胚两部分，分别对种子和种胚进行外植体的消毒灭菌；S2：扩繁；消毒灭菌后，将种子和种胚分别接种于添加了6‑BA、NAA和无外源激素的MS始芽及继代培养基中，观察始芽诱导及芽苗不定芽分化及生长情况；S3：生根；分别挑选顶芽叶片舒展、叶色翠绿、生长健壮和高3～4cm的单芽和2～3个芽苗的丛芽接种于生根培养基中；S4：移栽，选用泥炭土和黄心土，将其按体积为1∶5的比例搅拌均匀，将单芽和丛芽分别移栽至育苗杯中培育，移栽2个月后统计成活率。

技术研发人员：俞建妹,余注光,田湘,邓福春,张振林,韦金梅,李俊贞,何荣,刘玉军,朱其伍,甘宇,钟柳,沈遐,黎晓生,满有区,唐相红,苏峰,韦丽,伍萍萍,黄艳,阮雪琪,容志华,李明真,陈玉婷,陈碧珍,李婷,秦庆利,许涛
受保护的技术使用者：广西壮族自治区南宁良凤江国家森林公园
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13