一种玛卡普诺椰子的胚培养方法

本发明属于椰子组织培养，涉及一种玛卡普诺椰子的胚培养方法。

背景技术：

1、玛卡普诺椰子(macapuno，也拼写为makapuno)，是一种天然存在的椰子品种，其胚乳发育异常，这种异常发育的结果是一种柔软的半透明果冻状果肉(胚乳)几乎充满了椰子种子的整个中央空腔，几乎没有椰子水。由于胚乳(椰肉)是柔软的口感，吃起来口感软糯香甜，如同糯米一般，也称为糯米椰子。

2、玛卡普诺种子的胚胎是正常的，但周围异常的胚乳不能支持它们的萌发，从而使玛卡普诺种子有效地不育，因此，玛卡普诺椰子尽管被视为传统美食，但仍然稀有且昂贵。玛卡普诺椰子是所有椰子品种中价值最高的之一，在国内售价高达200元以上。

3、虽然将带有玛卡普诺椰子的棕榈树种植在一起或单独种植可以提高玛卡普诺椰子产量，但后代果实中再次出现表型的机会非常低，仅为2％至21％。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，胚污染率低、发芽率高，同时提高幼苗的存活率和生长特性，有利于玛卡普诺椰子的推广种植。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，包括：

4、1)玛卡普诺椰子砍开后，使用取胚器插入胚乳获取胚乳块；

5、2)用2.4％～4％(v/v)naocl冲洗胚乳块，在超净工作台中切开胚乳块，取出胚并放入无菌瓶中；将胚浸泡在70％～75％(v/v)乙醇中1～3分钟，紧接着浸泡在0.8％～2.1％(v/v)naocl中10分钟，用无菌蒸馏水冲洗胚胎后，将胚在超净工作台中吹干；

6、3)将表面灭菌的合子胚胎置于含糖50～60g/l和活性炭2～2.5g/l的固体培养基上，并在黑暗条件下，27±2℃培育至胚胎开始发芽；

7、4)将开始发芽的幼苗转移到含糖30g/l的液体培养基中，在光照强度25±2μmolm-2s-1，27±1℃条件下孵育，直到出现1到2片叶子；

8、5)之后每一个月，培养基中的糖成分减小10g/l直到降为零，同时培养环境中加入外源co2和不同光质的光照，得到可以移至户外栽培的幼苗。

9、优选地，步骤1)中，所述取胚器包括取胚管，所述取胚管长20cm，外直径3.5cm，壁厚0.3cm，钢制，前端打薄形成楔状，方便嵌入胚乳中，后部带有小棍，向前推可从前端推出含有胚的圆柱体胚乳块。

10、优选地，步骤1)中，在取玛卡普诺椰子的胚时，依据椰子底部三孔中较大的一个孔的位置，在胚乳的对应位置插入，取得含有胚的胚乳块。

11、优选地，步骤1)中，每次提取胚乳块时用70％(v/v)乙醇喷洒取胚器。

12、优选地，步骤2)中，用无菌蒸馏水冲洗胚胎5次，每次1分钟。

13、优选地，步骤3)中所述固体培养基和步骤4)中液体培养基中均含有：

14、y3大量营养素(mg/l)，硝酸钾kno3 2000.00，氯化钾kcl 1500.00，氯化铵nh4cl530.00，正磷酸二氢钠nah2po4·2h2o 310.00，氯化钙cacl2·2h2o295.00，硫酸镁mgso4·7h2o 250.00；

15、y3微量营养素(mg/l)：硫酸锰mnso4·4h2o 11.50，碘化钾ki 8.00，硫酸锌znso4·7h2o 7.30，硼酸h3bo3 3.00，硫酸铜cuso4·5h2o 0.270，氯化钴cocl2·6h2o 0.250，钼酸钠namoo4·h2o 0.250，氯化镍nicl·6h2o 0.026，硫酸亚铁fe2so4·7h2o 42.00，乙二胺四乙酸二钠na2edta56.0；

16、维生素和氨基酸(mg/l)：盐酸吡哆醇(维生素b6)c8h11no3·hcl 0.05，盐酸硫胺素(维生素b1)c12h17cln4os·hcl 0.05，烟酸(维生素b3)c6h5no20.05，泛酸钙(维生素b5)(c9h16no5)2ca 0.05，生物素(维生素h)c10h16n2o3s0.05，叶酸(维生素bc、维生素m)c19h19n7o60.05，甘氨酸c2h5no2 1.00；

17、其他添加物：脱落酸(aba(a))c15h20o4 0.25mg/l，α-萘乙酸(naa(b))c12h10o218.6mg/l，蔗糖c6h22o11 50～60.0g/l，活性炭2.0g/l。

18、更优选地，所述固体培养基中还含有琼脂7.0g/l或gelzan3.0 g/l，所述固体培养基和液体培养基高压灭菌前需要将ph值调节至5.7。

19、优选地，步骤3)中，培育时间为4～6周；步骤4)中，孵育时间为8～12周。

20、优选地，步骤4)和5)中，均采用红色70％加蓝色30％的led灯每日光照16小时。

21、优选地，步骤5)中，co2浓度为1,600μmolμmol-1，光照强度为600μmolm-2s-1。

22、本发明的有益效果在于：

23、(一)使用取胚器取胚，保证了玛卡普诺椰子的取胚成功率。

24、(二)基于玛卡普诺椰子的特性，专门配制了适用于玛卡普诺椰子的培养基，保证合子胚培养的发芽率。

25、(三)胚培过程中采用了降糖培养，能够降低污染率，增加植物的光能自养能力。

26、(四)培养环境中加入了外源co2和不同光质的光照，提高了胚培苗的生长性状和幼苗成活率。

技术特征：

1.一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，包括：

2.根据权利要求1所述的一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，其特征在于，步骤1)中，所述取胚器包括取胚管，所述取胚管长20cm，外直径3.5cm，壁厚0.3cm，钢制，前端打薄形成楔状，方便嵌入胚乳中，后部带有小棍，向前推可从前端推出含有胚的圆柱体胚乳块。

3.根据权利要求1所述的一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，其特征在于，步骤1)中，在取玛卡普诺椰子的胚时，依据椰子底部三孔中较大的一个孔的位置，在胚乳的对应位置插入，取得含有胚的胚乳块。

4.根据权利要求1所述的一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，其特征在于，步骤1)中，每次提取胚乳块时用70％乙醇喷洒取胚器。

5.根据权利要求1所述的一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，其特征在于，步骤2)中，用无菌蒸馏水冲洗胚胎5次，每次1分钟。

6.根据权利要求1所述的一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，其特征在于，步骤3)中所述的固体培养基和步骤4)中所述的液体培养基中均含有：

7.根据权利要求6所述的一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，其特征在于，所述固体培养基中还含有琼脂7.0g/l或gelzan3.0 g/l，所述固体培养基和液体培养基高压灭菌前需要将ph值调节至5.7。

8.根据权利要求1所述的一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，其特征在于，步骤3)中，培育时间为4～6周；步骤4)中，孵育时间为8～12周。

9.根据权利要求1～8任意一项所述的一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，其特征在于，步骤4)和5)中，均采用红色70％加蓝色30％的led灯每日光照16小时。

10.根据权利要求9所述的一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，其特征在于，步骤5)中，co2浓度为1,600μmolμmol-1，光照强度为600μmol m-2s-1。

技术总结
本发明提供了一种玛卡普诺椰子的胚培养方法，通过使用取胚器取胚，保证了玛卡普诺椰子的取胚成功率；基于玛卡普诺椰子的特性，专门配制了适用于玛卡普诺椰子的培养基，保证合子胚培养的发芽率；胚培过程中采用了降糖培养，能够降低污染率，增加植物的光能自养能力，同时，培养环境中加入了外源CO<subgt;2</subgt;和不同光质的光照，提高了胚培苗的生长性状和幼苗成活率，有利于玛卡普诺椰子的推广种植。

技术研发人员：穆治华,罗杰,肖勇,杨壮,夏薇,刘贤青,徐航,周骏杰,徐冉,李娇龙,李凤梅
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15