一种堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立方法

本发明属于生物，具体涉及一种堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立方法。

背景技术：

1、堇叶碎米荠(cardamine violifolia)是十字花科碎米荠属一年或两年生植物，也是我国恩施地区特有的超聚硒蔬菜，对硒具有极强的聚集和耐受能力，可积累高达92％以上的有机硒。自然环境生长的堇叶碎米荠中硒含量可达1365g/kg，地上部硒的生物富集系数最高可以达到43.8左右。作为一种具有高营养价值的超聚硒植物，可以作为保健食品原料和优良的植物源富硒饲料。

2、尽管堇叶碎米荠种植面积逐年增加，但由于堇叶碎米荠自花授粉及种子不耐储藏，在育种方面进展缓慢。随着分子生物学的发展，很多涉及到基因功能验证的实验需要通过组织培养进行遗传转化。本专利所述组培以堇叶碎米荠叶片为外植体，直接诱导愈伤分化得到完整的植株，为植物聚硒、耐硒机理研究提供植物来源，同时也可在生产实践及理论研究上得到具体应用。通过叶片组培再生体系，可以快速得到大量优质堇叶碎米荠幼苗，大幅降低生产成本。

技术实现思路

1、本发明目的之一是提供一种能够在生产和实验中得到应用的堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立方法。

2、为了解决上述问题，本发明提供了一种堇叶碎米荠叶片组培再生体系，可以快速获得大量优质的堇叶碎米荠幼苗。

3、本发明所采用的技术方案为：

4、一种堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立方法，主要包括以下步骤：

5、(1)外植体消毒：

6、选择堇叶碎米荠幼嫩叶片作为外植体，自来水冲洗后在超净工作台中先用乙醇消毒，再用无菌水冲洗、次氯酸钠消毒、无菌水冲洗；

7、(2)愈伤组织诱导：

8、将步骤(1)中处理的叶片用无菌解剖刀切成1cm×1cm的小块；将叶片正面向上接种到诱导培养基中光照培养15～20d得到愈伤组织；

9、(3)分化培养：

10、将步骤(2)中获得的愈伤组织转移至分化培养基中光照培养20～25d，培养出堇叶碎米荠不定芽；

11、(4)生根培养：

12、将步骤(3)中获得的丛生不定芽切成单株，待其长至1～3cm高同时具有三到五片叶子的芽时，转移至生根培养基中光照培养15～20d诱导生根，培养出堇叶碎米荠无菌再生苗；

13、(5)炼苗移栽：

14、待步骤(4)堇叶碎米荠无菌再生苗长至8～10cm时，转移到蛭石和珍珠岩组成的基质中，覆盖保鲜膜保湿，14天后去除保鲜膜，即完成堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立。

15、作为一种实施方式，步骤(2)中所述的诱导培养基包括：ms培养基4.74g/l、噻苯隆(tdz)0.4mg/l、玉米素(zt)1.0mg/l、萘乙酸(naa)0.1mg/l、硒酸钠(na2seo4)1.0mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.5g/l。

16、作为一种实施方式，步骤(3)中所述的分化培养基包括：ms培养基4.74g/l、噻苯隆(tdz)0.4mg/l、玉米素(zt)1.0mg/l、萘乙酸(naa)0.6mg/l、硒酸钠(na2seo4)1.0mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.5g/l。

17、作为一种实施方式，步骤(4)中所述的生根培养基包括：ms培养基4.74g/l、naa1.0mg/l、蔗糖30g/l、硒酸钠(na2seo4)1.0mg/l、琼脂7.5g/l。

18、作为一种实施方式，所述的诱导培养基、分化培养基、生根培养基的ph值均为5.8。

19、作为一种实施方法，所述的诱导培养基、分化培养基和生根培养基均添加了1mg/l的硒酸钠促进堇叶碎米荠叶片诱导和生长。

20、本发明的技术效果为：

21、本发明所述方法建立的堇叶碎米荠叶片高效组织培养再生体系，在不同培养阶段选用不同培养基和激素配比，提高堇叶碎米荠叶片脱分化和再分化比例，该方法可实现堇叶碎米荠的快速繁殖，为堇叶碎米荠优良品种的无性繁殖和遗传转化体系构建提供技术参考。

技术特征：

1.一种堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于，步骤(2)中所述的诱导培养基包括：ms培养基4.74g/l、噻苯隆(tdz)0.4mg/l、玉米素(zt)1.0mg/l、萘乙酸(naa)0.1mg/l、硒酸钠(na2seo4)1.0mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.5g/l。

3.根据权利要求1所述的堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于，步骤(3)中所述的分化培养基包括：ms培养基4.74g/l、噻苯隆(tdz)0.4mg/l、玉米素(zt)1.0mg/l、萘乙酸(naa)0.6mg/l、硒酸钠(na2seo4)1.0mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7.5g/l。

4.根据权利要求1所述的堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于，步骤(4)中所述的生根培养基包括：ms培养基4.74g/l、naa 1.0mg/l、蔗糖30g/l、硒酸钠(na2seo4)1.0mg/l、琼脂7.5g/l。

5.根据权利要求1～5任一项所述的堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于，所述的诱导培养基、分化培养基、生根培养基的ph值均为5.8。

技术总结
本发明公开了一种堇叶碎米荠叶片组培再生体系的建立方法，以及一种用于堇叶碎米荠的组培培养基及其应用。采用堇叶碎米荠叶片作为外植体，将叶片清洗灭菌后接种到诱导培养基中诱导15～20d得到愈伤组织，接着转移到分化培养基中培养20～25d，将1～3cm高的芽转移至生根培养基中生长15～20d诱导生根形成完整植株，将其移栽即可。通过上述方法建立的堇叶碎米荠叶片组培再生体系能够高效地获得堇叶碎米荠外植体再生苗，可为构建堇叶碎米荠遗传转化体系奠定基础，并为堇叶碎米荠优良品种培育繁殖提供技术参考，适合在生物技术领域推广利用。

技术研发人员：许锋,晁伟,陈强文,杨可,谢敏,叶家保,薛岩晟,邹华琳
受保护的技术使用者：长江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15