一种免疫细胞的冻存保护剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物，涉及一种免疫细胞的冻存保护剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要意义。在免疫细胞治疗中，一般采用羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，hes)离心沉淀法或ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(pbmc)。分离出的外周血单个核细胞(pbmc)含有淋巴细胞、红细胞、粒细胞等多种细胞成分，由于成分的复杂，细胞保存条件极其苛刻。虽然细胞储存的技术已经有了长足的进步，但是目前细胞储存还有很多的问题。例如粒细胞的保存一直都未得到好的解决。

2、目前冻存方法多采用的是dmso、动物血清和细胞培养液按不同比例搭配成的冻存液，例如cn102301992a公开的用于冻存单个核细胞的冻存液，其包含血浆和二甲基亚砜，还可以包含动物血清和培养基等成分，采用该冻存液的优点是细胞保存时间长，然而该冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可能性，会对人体过继免疫治疗产生一定影响。目前也有一些采用冻存液中不含动物血清的报道，例如，cn104026118a公开的免疫细胞冻存液，其包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫细胞基础培养基。采用该冷冻液的优点在于不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，然而该冷冻液冻存细胞的存活率以及细胞活性仍较低。

3、综上所述，开发新型的免疫细胞的冻存保护剂及保存方法，对于免疫细胞治疗领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种免疫细胞的冻存保护剂及其制备方法和应用，为有效保存免疫细胞提供新方法、新思路，有利于免疫细胞治疗领域的发展。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种免疫细胞的冻存保护剂，所述冻存保护剂包括培养基、自体血浆、二甲基亚砜、人血白蛋白和胎盘冻干粉。

4、本发明中，设计了全新的免疫细胞的冻存保护剂配方，各组分协同配合，能够使冻存后的细胞同时具有较高的活率和较强的细胞活性，同时对单个核细胞中的粒细胞成分有良好的保护作用，有效增加粒细胞成分的回收率。

5、本发明中，所述培养基指能够维持免疫细胞存活的培养基，市售的免疫细胞培养基均适用于本发明，例如gibco品牌rpmi-1640培养基。

6、本发明中，所述自体血浆指外周血制备分离单个核细胞过程中去除红细胞后得到的血浆。

7、本发明中，所述胎盘冻干粉指胎盘冻干粉是一种将新鲜胎盘进行处理和冻干的产品。冻干过程可以将胎盘中的水分去除，同时保留其中的生物活性成分和营养物质。胎盘冻干粉通常用于医疗和保健领域，被认为具有一些潜在的益处。例如市场在售的天美健牌胎盘冻干粉胶囊(卫生健号(1999)第120号)。

8、优选地，所述冻存保护剂中培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比为(50～60):(20～30):(10～15)，包括但不限于55:21:14、51:25:12、59:29:11、57:23:13、或53:26:13。

9、优选地，所述冻存保护剂中人血白蛋白的体积百分比为5％～10％，包括但不限于6％、7％、8％或9％。

10、优选地，所述冻存保护剂中胎盘冻干粉的体积百分比为5％～8％，包括但不限于6％或7％。

11、优选地，所述冻存保护剂中培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比为(50～60):(20～30):(10～15)，人血白蛋白的体积百分比为5％～10％，胎盘冻干粉体积百分比为5％～8％。

12、第二方面，本发明提供第一方面所述的免疫细胞的冻存保护剂的制备方法，所述制备方法包括：

13、将培养基、自体血浆、二甲基亚砜、人血白蛋白和胎盘冻干粉混合，得到所述免疫细胞的冻存保护剂。

14、第三方面，本发明提供第一方面所述的免疫细胞的冻存保护剂在保存免疫细胞中的应用。

15、第四方面，本发明提供一种免疫细胞的保存方法，所述保存方法包括：

16、将外周血单个核细胞配制成细胞悬液，将所述细胞悬液与第一方面所述的免疫细胞的冻存保护剂混合，得到混合液，对所述混合液进行降温处理，然后转入液氮中保存。

17、优选地，所述细胞悬液的细胞密度为1×106～1×108个/ml。

18、优选地，所述细胞悬液与免疫细胞的冻存保护剂的体积比为1:(10～20)，包括但不限于1:11、1:12、1:13、1:15、1:16、1:17、1:18或1:19。

19、优选地，所述降温处理包括(应用程序性降温的降温梯度为)：

20、a.4℃等待，至产品放入程序降温仪；

21、b.以5℃/min降至0℃，保持5min；

22、c.以2℃/min降至-10℃，保持5min；

23、d.以l℃/min降至-45℃，保持35min；

24、e.以5℃/min降至-90℃，保持5min；

25、f.结束。

26、优选地，所述保存方法还包括分离单个核细胞的步骤。

27、优选地，所述分离单个核细胞的方法包括：

28、采集新鲜的抗凝人外周血进行离心处理，分别提取血浆和外周血单个核细胞。

29、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

30、本发明设计了全新的免疫细胞的冻存保护剂配方，各组分协同配合，能够使冻存后的细胞同时具有较高的活率和较强的细胞活性，同时对单个核细胞中的粒细胞成分有良好的保护作用，有效增加粒细胞成分的回收率，细胞活性可达95％以上，中性粒细胞回收率可达88％以上，嗜酸性粒细胞回收率可达85％以上，总细胞回收率可达86％以上。

技术特征：

1.一种免疫细胞的冻存保护剂，其特征在于，所述冻存保护剂包括培养基、自体血浆、二甲基亚砜、人血白蛋白和胎盘冻干粉。

2.根据权利要求1所述的免疫细胞的冻存保护剂，其特征在于，所述冻存保护剂中培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比为(50～60):(20～30):(10～15)；

3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞的冻存保护剂，其特征在于，所述冻存保护剂中培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比为(50～60):(20～30):(10～15)，人血白蛋白的体积百分比为5％～10％，胎盘冻干粉体积百分比为5％～8％。

4.权利要求1-3任一项所述的免疫细胞的冻存保护剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

5.权利要求1-3任一项所述的免疫细胞的冻存保护剂在保存免疫细胞中的应用。

6.一种免疫细胞的保存方法，其特征在于，所述保存方法包括：

7.根据权利要求6所述的免疫细胞的保存方法，其特征在于，所述细胞悬液的细胞密度为1×106～1×108个/ml。

8.根据权利要求6或7所述的免疫细胞的保存方法，其特征在于，所述细胞悬液与免疫细胞的冻存保护剂的体积比为1:(10～20)。

9.根据权利要求6-8任一项所述的免疫细胞的保存方法，其特征在于，所述降温处理包括：

10.根据权利要求6-9任一项所述的免疫细胞的保存方法，其特征在于，所述保存方法还包括分离单个核细胞的步骤；

技术总结
本发明公开了一种免疫细胞的冻存保护剂及其制备方法和应用。所述冻存保护剂包括培养基、自体血浆、二甲基亚砜、人血白蛋白和胎盘冻干粉。本申请设计了全新的免疫细胞的冻存保护剂配方，各组分协同配合，能够使冻存后的细胞同时具有较高的活率和较强的细胞活性，同时对单个核细胞中的粒细胞成分有良好的保护作用，有效增加粒细胞成分的回收率。

技术研发人员：嵐山芮,许超
受保护的技术使用者：广州瑞铂茵健康科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15