一种肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法

本发明属于动物模型的构建方法，具体涉及一种肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法。

背景技术：

1、原发性肝癌是目前癌症相关死亡的主要原因，肝细胞癌(hcc)约占原发性肝癌的90％左右。近年来，肠道菌群在肝癌发生发展中的作用引起人们的关注，肠道菌群作为机体的第二大器官，在调控肿瘤的易感性和进展中起着重要的作用。肠道菌群通过门静脉与胆道系统与肝脏相连组成肠-肝轴，肝脏暴露于肠道菌群及其代谢物中，肠道微生物失调已被证明是影响hcc发生发展的关键决定因素和参与者。因此，研究肝癌患者肠道菌群与疾病的关系十分重要，但有时直接在人体进行相关的研究并不符合伦理道德，迫切需要在动物层面能够全面模拟肝癌患者肠道菌群微生态的模型。

2、目前人-鼠fmt粪菌移植已用于结肠炎、阿尔兹海默症等疾病的相关研究中，但是对于肠道菌群人源化hfa动物模型的构建标准未有定论，需要多长的粪菌移植周期可使人类肠道菌群在动物模型中定植？移植后人类肠道菌群能在动物体内定植多久？移植后的动物模型能否代表某一类人群的菌群特征？这些问题都迄待深入的探究。目前肝癌研究领域中缺乏肠道菌群人源化hfa动物模型，由于临床肝癌患者筛选的条件难以控制，无菌鼠价格的昂贵，这些都成为肠道菌群人源化肝癌小鼠模型构建的阻碍。侵袭与转移是肝癌重要的生物学特征，是引起肝癌患者死亡的主要因素。一般方法构建的动物模型难以在所有特征上都全面模拟人体的菌群环境，有必要进行提升。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，提高肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的模拟效果。

2、本发明提供一种肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，步骤为，用抗生素鸡尾酒消除balb/c裸鼠体内的肠道菌群，然后在balb/c裸鼠的脾脏原位注射huh-7 luc1细胞，构建得到转移型原位肝癌小鼠模型，然后通过灌胃方式将患有肝细胞癌的患者的粪便混悬液移植入所述的转移型原位肝癌小鼠模型内，得到肠道菌群人源化肝癌小鼠模型。

3、优选的，患有肝细胞癌的患者，包括肝内转移性肝细胞癌患者或者/和非转移性肝细胞癌患者。

4、优选的，患有肝细胞癌的患者为患有肝内转移性肝细胞癌的患者。

5、优选的，移植时间为21-28天，每天通过灌胃移植一次，得到肠道菌群人源化肝癌小鼠模型。

6、优选的，移植时间为28天。

7、优选的，所述抗生素鸡尾酒由1g/l氨苄西林、1g/l新霉素、0.5g/l甲硝唑和0.5g/l万古霉素组成。

8、优选的，用抗生素鸡尾酒消除balb/c裸鼠体内的肠道菌群的方法为，将抗生素鸡尾酒加入到balb/c裸鼠的饮用水中，连续饮用一周，每3天更换一次饮用水，就得到了消除了肠道菌群的balb/c裸鼠。

9、优选的，腹腔注射戊巴比妥钠以麻醉balb/c裸鼠，在balb/c裸鼠的脾脏原位注射huh-7 luc1细胞前，脾脏原位注射huh-7 luc1细胞的数量为3×106个，构建转移型原位肝癌小鼠模型。

10、优选的，在构建转移型原位肝癌小鼠模型后3天，开始进行粪便混悬液移植。

11、优选的，将28名患有肝内转移肝细胞癌的患者的新鲜粪便混合，以及26名非转移性肝细胞癌患者的新鲜粪便混合，粪便混合液进行过滤，离心，洗涤，得到两种肠道菌群混悬液，所述患有肝细胞癌的患者的肠道菌群混悬液中，菌群浓度为2.5×1012/50ml；灌胃方式的灌胃剂量为200ul/d。

12、本发明的有益效果是，本发明选用转移性肝癌模型小鼠，通过人-鼠粪菌移植的方法，分别将肝内转移性与非转移性hcc患者的肠道菌群移植入转移型原位肝癌小鼠肠道内，运用宏基因测序对肠道菌群的定植进行动态检测，结合小鼠肿瘤转移表型观察对模型的建立进行评价。通过建立肠道菌群人源化肝癌模型小鼠，模拟肝癌患者肠道菌群的临床特征，为探索肠道菌群在hcc发生发展中的病理生理机制提供研究基础，为早期发现和治疗hcc提供研究工具，对于寻找潜在的肝癌诊治方法，以及在未来实现肝癌转化研究及精准治疗等方面有着广泛的前景。

13、本发明在移植了肝内转移hcc患者肠道菌群3-4周后，显著促进了小鼠肿瘤的侵袭和转移。随后，受体小鼠肠道菌群的α多样性、微生物丰度与菌落结构、定植的优势菌属及其定植时间分析结果皆表明，通过3-4周的fmt，人源供体肠道菌群可以定植在肝癌小鼠受体肠道内，同时肠道菌群基因功能也得以复制，供体肠道菌群微生态成功在受体小鼠体内模拟。本发明成功构建了肠道菌群人源化肝癌小鼠的标准化模型，为hcc的肠道菌群相关研究提供了临床前关键模型。

14、本发明成功构建了肠道菌群人源化肝癌小鼠模型，通过3-4周的fmt，可使hcc人源菌群稳定定植在肝癌小鼠肠道内，肠道菌群基因功能也相应改变，肝癌患者肠道微生态的模式在小鼠受体中复制。同时，肝内转移患者肠道菌群的定植促进了肝癌小鼠肿瘤的侵袭与转移，肠道菌群失调是导致肝癌侵袭与转移的重要病因。首次在小鼠体内模拟了肝癌患者肠道菌群微生态，为肠道菌群人源化肝癌小鼠模型构建提供了实验依据。模型的构建为肝脏与肠道菌群相关机制研究、深入了解宿主微生物群的相互作用特征，以及开展肝癌微生态制剂、菌群靶向治疗、病原微生物筛查、肿瘤免疫治疗等提供临床前研究关键模型，是肝癌领域肠道菌群相关研究的一大技术革新。

技术特征：

1.一种肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，其特征是，用抗生素鸡尾酒消除balb/c裸鼠体内的肠道菌群，然后在balb/c裸鼠的脾脏原位注射huh-7 luc1细胞，构建得到转移型原位肝癌小鼠模型，然后通过灌胃方式将患有肝细胞癌的患者的粪便混悬液移植入所述的转移型原位肝癌小鼠模型内，得到肠道菌群人源化肝癌小鼠模型。

2.如权利要求1所述的肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，其特征是，患有肝细胞癌的患者，包括肝内转移性肝细胞癌患者或者/和非转移性肝细胞癌患者。

3.如权利要求2所述的肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，其特征是，患有肝细胞癌的患者为患有肝内转移性肝细胞癌的患者。

4.如权利要求1所述的肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，其特征是，移植时间为21-28天，每天通过灌胃移植一次，得到肠道菌群人源化肝癌小鼠模型。

5.如权利要求4所述的肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，其特征是，移植时间为28天。

6.如权利要求1-5任一项所述的肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，其特征是，所述抗生素鸡尾酒由1g/l氨苄西林、1g/l新霉素、0.5g/l甲硝唑和0.5g/l万古霉素组成。

7.如权利要求6所述的肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，其特征是，用抗生素鸡尾酒消除balb/c裸鼠体内的肠道菌群的方法为，将抗生素鸡尾酒加入到balb/c裸鼠的饮用水中，连续饮用一周，每3天更换一次饮用水，就得到了消除了肠道菌群的balb/c裸鼠。

8.如权利要求1-5任一项所述的肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，其特征是，腹腔注射戊巴比妥钠以麻醉balb/c裸鼠，在balb/c裸鼠的脾脏原位注射huh-7 luc1细胞，脾脏原位注射huh-7 luc1细胞的数量为3×106个，构建转移型原位肝癌小鼠模型。

9.如权利要求1-5任一项所述的肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，其特征是，在构建转移型原位肝癌小鼠模型后3天，开始进行粪便混悬液移植。

10.如权利要求1-5任一项所述的肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，其特征是，患有肝细胞癌的患者的粪便混悬液的制备方法为，分别将28名患有肝内转移肝细胞癌的患者的新鲜粪便混合，以及26名非转移性肝细胞癌患者的新鲜粪便混合，粪便混合液进行过滤，离心，洗涤，得到两种肠道菌群混悬液，所述患有肝细胞癌的患者的肠道菌群混悬液中，菌群浓度为2.5×1012/50ml；灌胃方式的灌胃剂量为200ul/d。

技术总结
本发明属于动物模型的构建方法，具体涉及一种肠道菌群人源化肝癌小鼠模型的构建方法，步骤为，用抗生素鸡尾酒消除BALB/c裸鼠体内的肠道菌群，然后在BALB/c裸鼠的脾脏原位注射Huh‑7Luc1细胞，构建得到转移型原位肝癌小鼠模型，然后通过灌胃方式将患有肝细胞癌的患者的粪便混悬液移植入所述转移型原位肝癌小鼠模型内，得到肠道菌群人源化肝癌小鼠模型；本发明在动物层面成功模拟了肝癌患者肠道肠道菌群微生态，成功构建了肠道菌群人源化肝癌小鼠模型。

技术研发人员：田雪飞,邓哲,周青,梅巳,戴晶晶
受保护的技术使用者：湖南中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16