成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法与流程

本发明属于柑橘离体组织培养，涉及成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法。

背景技术：

1、柑橘成年态枝条无菌化培养是进行柑橘良种微芽嫁接脱毒、节间茎段遗传转化和种质离体保存等工作的基础。迄今，柑橘成年态枝条无菌化处理方法多采用氯化汞(hgcl2)、次氯酸钠(naclo)和乙醇等配置的溶液等来进行。柑橘成年态枝条内外的微生物种类、数量与其枝条的生长条件、采取时间和成熟度等多种因素有关，一些无菌化处理方法的重复效果容易因时、因地和因人而异，甚至有时会出现无菌化不理想污染率高，或是枝条无菌化处理过度导致实验材料生活力显著下降等问题。此外，使用较高浓度的氯化汞和次氯酸钠等溶液无菌化处理成年态柑橘枝条时，对环境污染控制和操作人的安全防护等也提出了较高的要求。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

2、本发明再有一个目的是提供一种成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，通过本发明的无菌化培养出的冰糖橙外植体腋芽茎尖微芽嫁接成活率可达35.6％以上。本研究建立的柑橘成年态枝条无菌化培养方法污染率低，外植体腋芽活力均较高，能为进一步利用柑橘外植体组织培养加快柑橘良种脱毒提供工作基础。

3、为此，本发明提供的技术方案为：

4、一种成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，包括如下步骤：

5、步骤一、取冰糖橙结果树植株树冠外层芽点饱满的当年生半木质化枝条，将枝条剪截成8-10cm枝段用作成年态柑橘枝条外植体；

6、步骤二、将所述外植体清洗干净后，于无菌条件下，首先用乙醇浸泡所述外植体，然后naclo溶液浸泡所述外植体，再将所述外植体剪成每段带1-2个芽点的茎段，接种于含特美汀的ms培养基中，培养至腋芽长出；

7、步骤三、将所述腋芽茎尖嫁接到砧木上形成嫁接苗，并将所述嫁接苗置于ms基本液体培养基中培养。

8、优选的是，所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法中，步骤二中，采用体积分数75％的乙醇浸泡所述外植体15秒。

9、优选的是，所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法中，步骤二中，所述naclo溶液的浓度为2％(w/v)，采用浓度为2％的naclo溶液浸泡所述外植体10分钟。

10、优选的是，所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法中，步骤二中，所述含特美汀的ms培养基中特美汀的浓度为200-500mg/l。

11、优选的是，所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法中，所述含特美汀的ms培养基中特美汀的浓度为300mg/l。

12、优选的是，所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法中，步骤二中，将茎段接种于含特美汀的ms培养基中，培养方法包括：

13、光照条件为：12h光照/12h黑暗，光强40μm·m-2·s-1，温度保持在26-28℃。

14、优选的是，所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法中，步骤二中，所述含特美汀的ms培养基包含：ms粉0.441g/l，蔗糖30g/l，琼脂粉8g/l，和特美汀300mg/l；ph5.7-5.75。

15、优选的是，所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法中，步骤二中，所述培养时间为7-15天。

16、优选的是，所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法中，步骤三中，将所述腋芽茎尖嫁接到砧木上形成嫁接苗的方法包括：

17、取枳的黄化苗用作砧木，切去砧木顶端及根端，留茎长1.5-2cm，留根长4-5cm，

18、取外植体上萌发生长的腋芽茎尖作接穗，剥离带有2-3个叶原基的茎尖，采用倒“t”压法将茎尖置于砧木切口内并充分贴合完成嫁接。

19、本发明至少包括以下有益效果：

20、本发明中采用75％乙醇处理15s+2％naclo处理10min+300mg/l timentin的处理条件下茎段生长14天时的染菌率最低，这说明抑菌剂naclo和timentin结合使用时，抑菌效果能发生协同效应。本发明无菌化培养的腋芽茎尖(0.2-0.3mm)微芽嫁接成活率可达35.6％以上。说明，本发明柑橘枝条外植体无菌化培养出的腋芽生活力强，可适用于柑橘良种的茎尖微芽嫁接脱毒工作。本发明建立的柑橘成年态枝条无菌化培养方法，能有效的实现柑橘成年态枝条无菌化处理，处理后枝条外植体的成活率和腋芽活力均较高，有益于提高实验材料的利用效率。

21、本发明体现了在柑橘脱毒工作中，将物化处理与茎尖嫁接方法相结合能获得更好的脱毒效果，进一步探索了柑橘成年态枝条无菌化培养后外植体腋芽活力与各种物化处理条件的关系，将能为加速柑橘良种脱毒工作提供技术途径。

22、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

技术特征：

1.一种成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，其特征在于，步骤二中，采用体积分数75％的乙醇浸泡所述外植体15秒。

3.如权利要求1所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，其特征在于，步骤二中，所述naclo溶液的浓度为2％(w/v)，采用浓度为2％的naclo溶液浸泡所述外植体10分钟。

4.如权利要求1所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，其特征在于，步骤二中，所述含特美汀的ms培养基中特美汀的浓度为200-500mg/l。

5.如权利要求4所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，其特征在于，所述含特美汀的ms培养基中特美汀的浓度为300mg/l。

6.如权利要求1所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，其特征在于，步骤二中，将茎段接种于含特美汀的ms培养基中，培养方法包括：

7.如权利要求1所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，其特征在于，步骤二中，所述含特美汀的ms培养基包含：ms粉0.441g/l，蔗糖30g/l，琼脂粉8g/l，和特美汀300mg/l；ph5.7-5.75。

8.如权利要求1所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，其特征在于，步骤二中，所述培养时间为7-15天。

9.如权利要求1所述的成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，其特征在于，步骤三中，将所述腋芽茎尖嫁接到砧木上形成嫁接苗的方法包括：

技术总结
本发明公开了一种成年态柑橘枝条高效无菌化培养方法，包括：步骤一、取冰糖橙结果树植株树冠外层芽点饱满的当年生半木质化枝条，将枝条剪截成8‑10cm节段用作成年态柑橘枝条外植体；步骤二、将外植体清洗干净后，于无菌条件下，首先用乙醇浸泡外植体，然后NaClO溶液浸泡外植体，再将外植体剪成每段带1‑2个芽点的茎段，接种于含特美汀的MS培养基中，培养至腋芽长出；步骤三、将腋芽茎尖嫁接到砧木上形成嫁接苗，并将嫁接苗置于MS基本液体培养基中培养。本发明建立的柑橘成年态枝条无菌化培养方法，能有效的实现柑橘成年态枝条无菌化处理，处理后枝条外植体的成活率和腋芽活力均较高，有益于提高实验材料的利用效率。

技术研发人员：吴娟娟,张平,孔佑涵,刘娟,胡其军,张玉婷,张绍华
受保护的技术使用者：湖南省园艺研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27