一种冬枣黑斑病菌的接种方法与流程

本发明属于农业，具体涉及一种冬枣黑斑病菌的接种方法。

背景技术：

1、冬枣又名苹果枣，属于鼠李科枣属，由于它含有19种氨基酸及多种维生素，营养价值极其丰富，有“百果之王”和“活维生素丸”的美誉。随着冬枣栽培面积的迅速发展，因管理滞后，冬枣黑斑病的发生愈来愈重，该病主要危害叶片和果实，叶芽、枣股、花朵和果实均可发病，但其一般不侵染枝条。花芽上的病原菌为主要初侵染源，该病在冬枣坐果以前侵染叶片，之后从幼果开始危害果实。冬枣叶片感病初期失绿，后产生浅褐小斑点，并逐渐扩大成不规则褐色病斑，当斑点连接成片，叶片变黄卷曲，提早落叶，导致枣树生长缓慢。

2、据报道，目前关于冬枣黑斑病的致病菌接种大多采用果实作为样本，通过针刺方法进行接种。冬枣属于鼠李科落叶小乔木，体型较大，室内果树接种因不易操作，所以通常难以实现；而成熟的冬枣果实接种因受果期限制，导致可用于接种实验的时间范围有限。另外一种接种方法为叶片接种方法，而传统的叶片接种方法也只是通过离体的单独叶片作为接种材料。冬枣离体叶片相对于成熟果实更容易获取，是冬枣黑斑病接种的最佳样本。上述两种致病接种方法均存在鲜活组织离体培养后难以持续保湿状态，病菌接种效率低的问题。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供一种冬枣黑斑病菌的接种方法，以解决现有技术中的问题。

2、本发明的第一方面保护一种冬枣黑斑病菌的接种方法，包括如下步骤：

3、1)选取含叶片的冬枣枝条，消毒，晾干；

4、2)在所述冬枣枝条的叶片上造伤，将负载有黑斑病菌的第一载体置于所述造伤形成的伤口上，采用负载有无菌水的第二载体包裹所述冬枣枝条的末端，然后置于无菌三角瓶内并封口；

5、3)置于培养箱中培养。

6、优选的，1)中，所述消毒为采用70～75％酒精擦拭后，再用无菌水冲洗。

7、优选的，1)中，所述冬枣枝条的长度为8～12cm。

8、优选的，1)中，所述冬枣枝条的叶片数量为5～7片。

9、优选的，1)中，所述三角瓶的大小可以与冬枣枝条的长度相匹配。如冬枣枝条上生长5-7片叶时，枝条大约长10cm左右，采用500ml的三角瓶即可。

10、优选的，2)中，所述造伤为在叶片的主叶脉的一侧用尖针刺4～6次。优选为6次。本申请在叶脉的一侧针刺避开叶脉进行接种，有利于黑斑病菌更容易从非叶脉处的气孔侵入；且一侧针刺能控制创面大小，两侧都针刺会导致创面太大不利于接种黑斑病菌。

11、优选的，2)中，封口时，采用封口膜进行。所述透气膜的孔径为0.2～0.3μm。封口膜在保证空气交换不会有粉尘及霉菌进入三角瓶内的同时还能达到隔菌的目的，封口膜可以通过市售渠道获得，例如bkmamlab组培封口膜、biosharp透气封口膜。

12、优选的，2)中，所述第一载体选自灭菌滤纸片或无纺布。优选的，为灭菌滤纸片。更优选的，所述灭菌滤纸片的大小为(0.1～0.3cm)×(0.1～0.3cm)。第一载体的面积大小覆盖造伤的伤口即可。在一个具体的实施方式中，灭菌滤纸片的大小为0.3cm×0.3cm。

13、优选的，2)中，所述第二载体选自棉球。棉球上负载有水，能营造保湿环境。

14、优选的，2)中，所述黑斑病菌为黑斑病菌的孢子悬液；以孢子悬浮液的总体积为基准计，所述黑斑病菌的孢子悬浮液中孢子的浓度为5×105～5×107个/ml。

15、优选的，2)中，所述黑斑病菌的培养方法为：采用组织法从带有黑斑病症状的叶片分离获得。

16、更优选的，将带有黑斑病症状的叶片剪成组织块，消毒，置于pda培养基上进行培养。

17、进一步优选的，所述消毒为先用酒精浸泡，接着在次氯酸钠溶液中浸泡，然后用无菌水冲洗。

18、进一步优选的，所述黑斑病的孢子悬浮液为黑斑病菌于20～35℃培养4～10d后，诱导产生新生的孢子囊。在一个具体实施方式中，为28℃培养7d。

19、优选的，3)中，所述培养的温度为20～35℃。

20、优选的，3)中，所述培养的时间为4～7d。

21、更优选的，所述培养的时间为，光照培养10～22h后，再黑暗培养4～12h。在一个具体实施方式中，为光照培养16h，再进行黑暗培养8h。

22、优选的，3)中，所述培养的湿度为70％～90％。

23、本申请通过采用鲜嫩枝条，同时通过锥形瓶保湿，相对于传统的单个叶片接种可以最大限度延长枝条叶片鲜活时间，提高病菌接种的效率和质量。

24、本发明的有益效果是：

25、1)本发明选择冬枣含5-7片叶的健康的嫩枝作为接种材料，而传统的接种方法是直接剪取叶片进行接种，选用嫩枝的优点在于能最大程度的保持离体接种材料的湿度(连续4天湿度能维持为80％以上，不需额外保湿)和新鲜度(叶片在接种期间无萎蔫、发黄和脱落情况)；同时，采用三角瓶或锥形瓶进行保湿，成本低，可操作性强，采用肉眼观察即可判定接种效果；此外，本发明的方法操作简单，成本低，且致病率为100％，提高了接种效率。

26、2)本发明选择灭菌后的三角瓶作为接种装置，营造温室环境下冬枣叶片的接菌环境，易于后期保湿和观察。

27、3)本发明选择的接种材料，相对于成熟果实来说不受生育期的时间限制，更容易获取，且成本低；相对于单个叶片接种来说有利于能维持叶片的营养和湿度，有利于病菌的侵入定殖，发病率和病斑面积比率均比较高；此外，本申请的接种方法对接种材料损伤更小。

28、4)本发明的方法易于操作，成本低；操作过程中温度、湿度容易控制，污染因素较小，能获得理想的接种致病效果，具有良好的实用性。

29、5)本发明的冬枣黑斑病菌离体叶片接种方法能快速提高冬枣对黑斑病的发病率，接种效果好，尤其是感病的冬枣叶片发病率可达到100％。

30、6)本发明的接种方式高效，可以为抗感染冬枣品种筛选提供技术支持，为冬枣黑斑病的抗病机制分析提供重要的理论依据，也可为其他果树病菌的接种提供参考。

技术特征：

1.一种冬枣黑斑病菌的接种方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的接种方法，其特征在于，1）中，所述消毒为采用70～75%酒精擦拭后，再用无菌水冲洗；

3.如权利要求1所述的接种方法，其特征在于，2）中，所述造伤为在叶片的主叶脉的一侧用尖针刺4～6次；

4.如权利要求1所述的接种方法，其特征在于，2）中，所述第一载体选自灭菌滤纸片或无纺布，所述灭菌滤纸片的大小为（0.1～0.3cm）×（0.1～0.3cm）；

5.如权利要求1所述的接种方法，其特征在于，2）中，所述黑斑病菌为黑斑病菌的孢子悬液；优选的，以孢子悬浮液的总体积为基准计，所述黑斑病菌的孢子悬浮液中孢子的浓度为5×105～5×107个/ml。

6.如权利要求5所述的接种方法，其特征在于，所述黑斑病菌的培养方法为：采用组织法从带有黑斑病症状的叶片分离获得；优选的，将带有黑斑病症状的叶片剪成组织块，消毒，置于pda培养基上进行培养。

7.如权利要求6所述的接种方法，其特征在于，所述消毒为先用酒精浸泡，接着在次氯酸钠溶液中浸泡，然后用无菌水冲洗。

8.如权利要求5所述的接种方法，其特征在于，所述黑斑病的孢子悬浮液为黑斑病菌于20～35℃培养4～10d后，诱导产生孢子囊。

9.如权利要求1所述的接种方法，其特征在于，所述培养的温度为20～35℃；

10.如权利要求9所述的接种方法，其特征在于，所述培养的时间为，光照培养10～22h后，再黑暗培养4～12h。

技术总结
本发明公开了一种冬枣黑斑病菌的接种方法。所述接种方法包括如下步骤：1）选取含叶片的冬枣枝条，消毒，晾干；2）在所述冬枣枝条的叶片上造伤，将负载有黑斑病菌的第一载体置于所述造伤形成的伤口上，采用负载有无菌水的第二载体包裹所述冬枣枝条的末端，然后置于无菌三角瓶内并封口；3）置于培养箱培养。本发明通过采用含叶片的鲜嫩枝条为接种对象，同时通过三角瓶保湿进行冬枣黑斑病菌的接种；相对于传统的单个叶片接种，本发明的方法能最大限度延长枝条叶片鲜活时间，提高病菌接种的效率和质量。

技术研发人员：雷早娟,安鹏天,史云鹏,武亚明,刘子欢
受保护的技术使用者：中华人民共和国黄骅港海关
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15