A型甘露糖赤藓糖醇脂抑制微生物生物膜形成的应用和抑制方法

本发明属于抑菌，具体涉及a型甘露糖赤藓糖醇脂抑制微生物生物膜形成的应用和抑制方法。

背景技术：

1、生物膜(biofilm)是一种由微生物细胞和胞外聚合物质(extracellularpolymeric substances，eps)组成的具有空间立体结构的复杂微生物群落，可以附着在生物或非生物表面，并表现出表型和基因型的变化。与浮游细胞相比，生物膜的形成可以增强病原菌对抗生素及其他抗菌剂的抗性和对极端环境(如低温，高盐，低ph等)的耐受性。从而导致病原菌可以在食品加工环境中长期存活，形成持久性污染，对食品安全造成重大隐患。研究表明人类中超过80％的细菌感染与生物膜有关，大约60％的食源性疾病暴发是由生物膜引起的。生物膜的形成是一个动态变化的过程，主要包括可逆黏附、不可逆黏附、生物膜成熟i阶段、ii阶段(分别涉及簇和微菌落形成)以及分散阶段等五个主要阶段。在可逆黏附过程中，细菌通过细胞极化或鞭毛附着在基质上，然后进行纵向附着。在过渡到不可逆附着时，鞭毛逆转率的降低、鞭毛基因表达的减少和生物膜基质成分的产生同时发生，并且此阶段贴壁细胞还会表现出耐药性。生物膜成熟阶段的特点是出现细胞簇，并嵌入生物膜基质中(成熟i阶段)，随后完全成熟为微菌群(成熟ii阶段)。分散阶段则伴随着基质成分的减少和降解，分散的细胞是可移动的，并且相对于生物膜细胞显示出更强的药物敏感性。

2、单增李斯特菌是一种具有代表性的革兰氏阳性食源性致病菌，它可以通过污染海鲜、乳制品、水果、蔬菜、肉类和即食食品而引起人类感染。严重的单增李斯特菌感染可以引起肠胃炎、败血症、脑膜炎和流产，对于孕妇和儿童等免疫力低下群体，感染后的危害更大，死亡率在20％到30％之间。研究发现食源性致病菌单增李斯特菌除了具有较强的抗逆性外，其生物膜形成能力与其在食品加工环境中的生存密切相关，通过形成生物膜单增李斯特菌能够持续数月甚至数年。单增李斯特菌在形成生物膜后其致病性、抗逆性和耐药性会明显增强，从而导致其在食品加工环境中的持续传播和交叉污染，引发食源性疾病的爆发和食品产业的重大经济损失。因此从食品加工设施中消除生物膜引起的污染给食品产业的发展和食品安全的防控带来巨大的挑战。

3、近年来随着抗生素在农业、环境、动物和医学中的大量使用，导致了耐药病原菌的大量出现和增强，由抗生素耐药性(amr)引起的全球危机正在变得越来越严峻。天然抗菌剂尤其是天然生物类抗菌剂的研发为耐药病原菌的防控带来了新的希望。甘露糖赤藓糖醇脂(mannosylerythritol lipids，mels)是一种具有两亲特性的生物类表面活性剂，包含以4-o-β-d-吡喃甘露糖-赤藓糖醇为主的亲水基团和脂肪酸链为主的疏水基团。根据乙酰化程度的不同mels可以分为四种不同构型，其中a型甘露糖赤藓糖醇脂(mel-a)在c4和c6位双乙酰化，mel-b和mel-c分别在c6和c4位单乙酰化，而mel-d没有乙酰基。结构上的多样性赋予了mels特殊的生物学特性，包括生物降解性、环境相容性、抗氧化、抗肿瘤、抗菌活性、皮肤保湿作用和酶激活/抑制作用等多种特性。mels在医学、制药、化妆品和食品领域都具有广阔的应用前景。

4、因此，开发一种能够有效抑制单增李斯特菌生物膜形成的方法是本领域技术人员需要解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供mel-a抑制微生物生物膜形成的应用和抑制方法，mel-a对单增李斯特菌生物膜的形成具有显著的抑制作用，并且mel-a能够显著降低生物膜厚度与生物膜内活细胞比例。

2、本发明提供了一种a型甘露糖赤藓糖醇脂在抑制食源性致病菌生物膜形成中的应用。

3、优选的，所述a型甘露糖赤藓糖醇脂的结构式如式i所示；

4、

5、优选的，所述食源性致病菌包括单增李斯特菌(listeria monocytogenes)。

6、优选的，所述抑制食源性致病菌生物膜形成包括：降低生物膜厚度和/或降低生物膜内活细胞比例。

7、优选的，所述抑制食源性致病菌生物膜形成包括以下至少一项：(1)抑制生物膜内细菌的早期活力；

8、(2)降低食源性致病菌的爬行运动能力和/或初期粘附性；

9、(3)降低食源性致病菌胞外聚合物的分泌；

10、(4)抑制鞭毛运动相关基因和/或毒力基因的表达；

11、(5)上调不饱和脂肪酸、脂类和/或糖苷类代谢物；

12、(6)下调氨基酸代谢和/或核酸代谢。

13、本发明还提供了一种抑制食源性致病菌生物膜形成的方法，包括以下步骤：在食品的原料、成品和/或包装中添加a型甘露糖赤藓糖醇脂。

14、优选的，所述a型甘露糖赤藓糖醇脂的添加量不少于最小生物膜抑菌浓度或最小生物膜杀菌浓度。

15、优选的，所述a型甘露糖赤藓糖醇脂针对单增李斯特菌的最小生物膜抑菌浓度为64μg/ml菌液；

16、所述a型甘露糖赤藓糖醇脂针对单增李斯特菌的最小生物膜杀菌浓度为256μg/ml菌液。

17、有益效果：本发明提供了一种a型甘露糖赤藓糖醇脂(mel-a)在抑制食源性致病菌生物膜形成中的应用，实施例中以单增李斯特菌为例进行了验证，mel-a对单增李斯特菌生物膜的形成具有显著的抑制作用，最小生物膜抑菌浓度(mbic)和最小生物膜杀菌浓度(mbec)分别为64μg/ml和256μg/ml，并且mel-a能够显著降低生物膜厚度与生物膜内活细胞比例。

18、具体的：(1)mel-a显著抑制了生物膜内细菌的早期活力。经过1/4mbic和1/2mbic的mel-a处理6h后细菌活力分别降低了42％和62％。

19、(2)mel-a显著降低了单增李斯特菌的爬行运动能力和初期粘附性，处理浓度达到1/2mbic时爬行运动能力降低了45％，粘附性降低了15％。

20、(3)mel-a显著降低了单增李斯特菌胞外聚合物的分泌，影响程度为：多糖>edna>蛋白，通过影响胞外多糖的分泌进而影响细菌的黏附，可能是mel-a抑制生物膜形成的重要原因之一。

21、(4)实时荧光定量pcr分析(rt-qpcr)结果表明mel-a可以通过抑制鞭毛运动相关基因和毒力基因的表达进而抑制单增李斯特菌生物膜的形成。

22、(5)非靶向代谢组学分析结果表明mel-a通过显著上调不饱和脂肪酸、脂类以及糖苷类代谢物影响了细胞膜的流动性与通透性，通过显著下调氨基酸代谢和核酸代谢影响了蛋白质的生物合成、核苷酸代谢以及dna的合成与修复，这些因素可能是mel-a抑制生物膜形成的关键作用机制。

技术特征：

1.一种a型甘露糖赤藓糖醇脂在抑制食源性致病菌生物膜形成中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述a型甘露糖赤藓糖醇脂的结构式如式i所示；

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述食源性致病菌包括单增李斯特菌(listeria monocytogenes)。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抑制食源性致病菌生物膜形成包括：降低生物膜厚度和/或降低生物膜内活细胞比例。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述抑制食源性致病菌生物膜形成包括以下至少一项：(1)抑制生物膜内细菌的早期活力；

6.一种抑制食源性致病菌生物膜形成的方法，其特征在于，包括以下步骤：在食品的原料、成品和/或包装中添加a型甘露糖赤藓糖醇脂。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述a型甘露糖赤藓糖醇脂的添加量不少于最小生物膜抑菌浓度或最小生物膜杀菌浓度。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述a型甘露糖赤藓糖醇脂针对单增李斯特菌的最小生物膜抑菌浓度为64μg/ml菌液；

技术总结
本发明公开了A型甘露糖赤藓糖醇脂抑制微生物生物膜形成的应用和抑制方法，属于抑菌技术领域。本发明提供了A型甘露糖赤藓糖醇脂(MEL‑A)在抑制食源性致病菌生物膜形成中的应用，MEL‑A对单增李斯特菌生物膜的形成具有显著的抑制作用，并且MEL‑A能够显著降低生物膜厚度与生物膜内活细胞比例。本发明还提供了抑制机理，如MEL‑A显著抑制生物膜内细菌的早期活力、显著降低单增李斯特菌的爬行运动能力和初期粘附性、显著降低单增李斯特菌胞外聚合物的分泌、通过抑制鞭毛运动相关基因和毒力基因的表达进而抑制单增李斯特菌生物膜的形成。

技术研发人员：陈启和,刘夏雨,舒琴,张培潮
受保护的技术使用者：浙江大学长三角智慧绿洲创新中心
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17