以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法

本发明涉及植物组织培养。更具体地说，本发明涉及一种用于以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法。

背景技术：

1、无芒雀麦是禾本科雀麦属多年生草本植物，广布于我国各省区。无芒雀麦是优良牧草，具有抗旱、耐寒、耐盐碱、适应性强、叶量丰富、草质柔软、营养价值高、产量大等优点，是建立人工草场的主要草种，同时其根系发达、地下茎强壮、蔓延能力强，是防风固沙、退化土地修复的优势草种。

2、随着我国饲草需求的不断增长，对优质饲草无芒雀麦的需求也日益激增，传统的育种方法周期长，性状不稳定，不能满足日益激增的需求，而无性繁殖和生物育种技术则可以避免这些缺陷，且可加速育种进程。目前，基因工程较为成熟，通过转基因技术在牧草中引入抗逆或抗病虫害基因，将目的基因通过遗传转化技术整合到植物基因组中，可以成功提高牧草的抗性。稳定高效的植物再生体系是遗传转化成功及获得转基因植株的关键，无论是建立稳定高效的再生体系还是遗传转化体系，均受多种因素影响，研究难度大。

3、目前国内对无芒雀麦再生体系建立的研究还较少，公告号为cn104137774b、名称为无芒雀麦成熟种子组织培养再生的方法的发明专利中公开了通过不同激素的配比建立无芒雀麦成熟种子组织培养再生体系的方法，其以无芒雀麦成熟种子作为外植体经过分化培养基、诱导培养基、第一继代培养基、第二继代培养基和生根培养基的培养，并具体公开了分化培养基、诱导培养基、第一继代培养基、第二继代培养基和生根培养基的配比，第一，该建立无芒雀麦成熟种子组织培养再生体系的方法以无芒雀麦成熟种子作为外植体，还需要经过继代培养才能获得再生苗，诱导率低，建立再生体系的效率低，第二，该建立无芒雀麦成熟种子组织培养再生体系的方法中公开的各种培养基的配比产生胚性愈伤组织所需的时间长、分化时间长，出苗时间长，获得无芒雀麦再生苗的周期长。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

2、本发明还有一个目的是提供一种以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其以下胚轴为外植体建立的无芒雀麦再生体系，诱导率高、分化率高、易于生根、无需经过继代培养即可获得再生苗，极大地提高了建立无芒雀麦再生体系的效率，本申请中建立无芒雀再生体系的各个培养基经过科学有效的配比，极大提高了愈伤组织的诱导率，产生胚性愈伤组织所需时间短、分化时间短、出苗时间短，缩短了获得再生苗的周期。

3、为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，包括以下步骤：将经过预处理的无芒雀麦种子接种于萌发培养基上至长出具有胚轴的幼苗，在超净台中，取所得幼苗的小段下胚轴依次进行愈伤组织的诱导、愈伤组织的芽分化、愈伤组织的生根诱导即可炼苗移栽；其中，所述萌发培养基为：以ms 4～5g/l为基础培养基，附加包括蔗糖30～35g/l和植物凝胶3～4g/l，ph值为5.7～5.8。

4、优选的是，所述愈伤组织的诱导过程为：在超净台中，取小段下胚轴置于诱导培养基上，并于23～27℃的黑暗培养箱中培养30～35d，其中，所述诱导培养基为：以ms 4～5g/l为基础培养基，附加包括2,4-d1.0～3.0mg/l、6-ba0.1～1.0mg/l、蔗糖30～35g/l和植物凝胶3～4g/l，ph值为5.7～5.8。

5、优选的是，所述愈伤组织的芽分化过程为：在超净台中，取诱导后的愈伤组织置于芽分化培养基上培养15～20d，其中，所述芽分化培养基为：以ms 4～5g/l为基础培养基，附加包括naa0.5～2.0mg/l、6-ba0.5～2.0mg/l、肌醇50～100mg/l、水解酪蛋白200～500mg/l、蔗糖30～35g/l和植物凝胶3～4g/l，ph值为5.7～5.8。

6、优选的是，所述愈伤组织的生根诱导过程为：在超净台中，取芽分化后的愈伤组织置于生根培养基上培养30～35d，其中，所述生根培养基为：以ms 4～5g/l为基础培养基，附加包括蔗糖30～35g/l和植物凝胶3～4g/l，ph值为5.7～5.8。

7、优选的是，所述萌发培养基为以ms4.44g/l为基础培养基，附加包括蔗糖30g/l和植物凝胶3g/l，ph值为5.7～5.8；所述诱导培养基为：以ms4.44g/l为基础培养基，附加包括2,4-d2.0mg/l、6-ba1.0mg/l、蔗糖30g/l和植物凝胶3g/l，ph值为5.7～5.8；所述芽分化培养基为：以ms4.44g/l为基础培养基，附加包括naa 2.0mg/l、6-ba1.0mg/l、肌醇75mg/l、水解酪蛋白350mg/l、蔗糖30g/l和植物凝胶3g/l，ph值为5.7～5.8；所述生根培养基为：以ms4.44g/l为基础培养基，附加包括蔗糖30g/l和植物凝胶3g/l，ph值为5.7～5.8。

8、优选的是，无芒雀麦种子预处理过程包括：剥掉无芒雀麦种子稃皮后置于三角瓶中，依次进行以下操作：使用体积分数为75％乙醇消毒1～2min、无菌水冲洗、体积分数20％次氯酸钠灭菌10～15min、无菌水冲洗、无菌水浸泡10～12h。

9、优选的是，小段下胚轴的长度为0.5～1cm。

10、优选的是，愈伤组织的芽分化过程中所用诱导后的愈伤组织为筛选的淡黄色颗粒状胚型愈伤组织。

11、优选的是，愈伤组织的生根过程所用芽分化后的愈伤组织为已经分化成芽的愈伤组织。

12、优选的是，所述炼苗移栽过程包括：待愈伤组织生根至形成具有发达根系的组培苗，取出组培苗，洗净后采用基质土移栽，在室温下培养至新生叶片复壮后，移至室外培养。

13、本发明至少包括以下有益效果：本发明提供的无芒雀麦再生方法采用下胚轴为外植体，消毒操作简单、易于实施、无需使用升汞等有毒试剂、安全环保，且外植体活力强，有利于提高诱导率；本发明提供的无芒雀麦再生方法所获得的愈伤组织大部分呈黄色、紧密、颗粒状，其分化率高，且易于生根，极大地提高了胚性愈伤组织的获得率以及建立再生体系的效率；本发明进一步公开了无芒雀麦再生方法中各培养的科学配比，极大提高了愈伤组织的诱导率，产生胚性愈伤组织所需时间短、分化时间短、出苗时间短，极大地缩短了获得再生苗的周期；本发明提供的无芒雀麦再生方法操作简单，无需经过壮苗和继代培养即可获得再生苗，再生效率高；本发明提供的无芒雀麦再生方法通过使用少量的植物激素就可以高效地达到繁育无芒雀麦的目的，为工厂化育苗提供技术支撑，同时也降低了因激素价格高而带来的高成本；本发明提供的无芒雀麦再生方法通过加入肌醇和水解酪蛋白，一方面可以提供植物新生芽萌发与增殖对营养物质的需求，另一方面还可以有效预防愈伤褐化带来的组织死亡。

14、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

技术特征：

1.以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，包括以下步骤：将经过预处理的无芒雀麦种子接种于萌发培养基上至长出具有胚轴的幼苗，在超净台中，取所得幼苗的小段下胚轴依次进行愈伤组织的诱导、愈伤组织的芽分化、愈伤组织的生根诱导即可炼苗移栽；其中，所述萌发培养基为：以ms 4～5g/l为基础培养基，附加包括蔗糖30～35g/l和植物凝胶3～4g/l，ph值为5.7～5.8。

2.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，所述愈伤组织的诱导过程为：在超净台中，取小段下胚轴置于诱导培养基上，并于23～27℃的黑暗培养箱中培养30～35d，其中，所述诱导培养基为：以ms4～5g/l为基础培养基，附加包括2,4-d1.0～3.0mg/l、6-ba0.1～1.0mg/l、蔗糖30～35g/l和植物凝胶3～4g/l，ph值为5.7～5.8。

3.如权利要求2所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，所述愈伤组织的芽分化过程为：在超净台中，取诱导后的愈伤组织置于芽分化培养基上培养15～20d，其中，所述芽分化培养基为：以ms4～5g/l为基础培养基，附加包括naa0.5～2.0mg/l、6-ba0.5～2.0mg/l、肌醇50～100mg/l、水解酪蛋白200～500mg/l、蔗糖30～35g/l和植物凝胶3～4g/l，ph值为5.7～5.8。

4.如权利要求3所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，所述愈伤组织的生根诱导过程为：在超净台中，取芽分化后的愈伤组织置于生根培养基上培养30～35d，其中，所述生根培养基为：以ms4～5g/l为基础培养基，附加包括蔗糖30～35g/l和植物凝胶3～4g/l，ph值为5.7～5.8。

5.如权利要求4所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，所述萌发培养基为以ms4.44g/l为基础培养基，附加包括蔗糖30g/l和植物凝胶3g/l，ph值为5.7～5.8；所述诱导培养基为：以ms4.44g/l为基础培养基，附加包括2,4-d2.0mg/l、6-ba1.0mg/l、蔗糖30g/l和植物凝胶3g/l，ph值为5.7～5.8；所述芽分化培养基为：以ms4.44g/l为基础培养基，附加包括naa2.0mg/l、6-ba1.0mg/l、肌醇75mg/l、水解酪蛋白350mg/l、蔗糖30g/l和植物凝胶3g/l，ph值为5.7～5.8；所述生根培养基为：以ms4.44g/l为基础培养基，附加包括蔗糖30g/l和植物凝胶3g/l，ph值为5.7～5.8。

6.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，无芒雀麦种子预处理过程包括：剥掉无芒雀麦种子稃皮后置于三角瓶中，依次进行以下操作：使用体积分数为75％乙醇消毒1～2min、无菌水冲洗、体积分数20％次氯酸钠灭菌10～15min、无菌水冲洗、无菌水浸泡10～12h。

7.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，小段下胚轴的长度为0.5～1cm。

8.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，愈伤组织的芽分化过程中所用诱导后的愈伤组织为筛选的淡黄色颗粒状的胚型愈伤组织。

9.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，愈伤组织的生根过程所用芽分化后的愈伤组织为已经分化成芽的愈伤组织。

10.如权利要求1所述的以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，其特征在于，所述炼苗移栽过程包括：待愈伤组织生根至形成具有发达根系的组培苗，取出组培苗，洗净后采用基质土移栽，在室温下培养至新生叶片复壮后，移至室外培养。

技术总结
本发明涉及植物组织培养技术领域，公开了一种以下胚轴为外植体的无芒雀麦再生方法，包括以下步骤：将经过消毒处理的无芒雀麦种子接种于萌发培养基上至长出具有胚轴的幼苗，在超净台中，取所得幼苗的小段下胚轴依次进行愈伤组织的诱导、愈伤组织的芽分化、愈伤组织的生根诱导即可炼苗移栽；其中，所述萌发培养基为：以MS 4～5g/L为基础培养基，附加包括蔗糖30～35g/L和植物凝胶3～4g/L，pH值为5.7～5.8。本发明建立无芒雀再生体系的各个培养基经过科学有效的配比，极大提高了愈伤组织的诱导率，产生胚性愈伤组织所需时间短、分化时间短、出苗时间短，缩短了获得再生苗的周期，为后续无芒雀麦遗传转化、组培扩繁和脱毒种质研究提供了新的途径。

技术研发人员：伏兵哲,宋文学,高雪芹,王星,王晶,叶雨浓,李小红
受保护的技术使用者：宁夏大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24