本发明涉及医药的，尤其是涉及一种联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法。
背景技术：
1、哮喘是一种由多种炎症细胞和炎症介质参与的慢性气道炎症性疾病，其临床表现包括反复发作的喘息、呼吸困难、胸闷及咳嗽。部分患者在遭遇病毒感染、空气污染或过敏原再暴露等因素刺激后，易出现哮喘急性加重（asthma exacerbation），表现为炎症反应升级、气道高反应性增强以及对糖皮质激素治疗的敏感性降低。
2、目前常用的哮喘动物模型多采用单一过敏原（如卵清蛋白或屋尘螨）进行致敏与激发，能够模拟哮喘的基础炎症状态，但难以真实再现临床中多因素共同作用下的急性加重情境。这些传统模型存在以下不足：（1）仅能诱导典型th2型炎症反应，缺乏与临床重症哮喘相关的中性粒细胞炎症和th17反应；（2）模型稳定性差，加重期持续时间短；（3）缺乏气道黏液过度分泌、平滑肌增厚等重度哮喘的典型病理学特征。
3、因此，亟需一种能够综合模拟过敏原、病原微生物感染与环境污染等多因素作用，并可诱导出临床重症哮喘典型病理表现的动物模型，以满足哮喘加重机制研究和新药筛选的需要。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法。
2、一种联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法，包括如下步骤：
3、（1）致敏阶段：选用实验动物，于第1天和第14天通过腹腔注射过敏原溶液进行致敏；
4、（2）气道激发阶段：在致敏后，于第21～27天连续进行雾化吸入所述过敏原溶液进行气道再暴露；
5、（3）加重诱导阶段：在第24～27天，于气道内给予病原微生物，同时每日进行pm2.5气溶胶暴露；
6、（4）模型评估阶段：在第28天，采集肺组织、支气管肺泡灌洗液及血清进行检测。
7、优选的，所述过敏原采用卵清蛋白或屋尘螨提取物。
8、优选的，所述病原微生物选自细菌、真菌或病毒中的一种或多种。
9、优选的，所述病原微生物选自铜绿假单胞菌、肺烟曲霉菌或呼吸道合胞病毒的一种或多种。
10、优选的，所述pm2.5气溶胶的浓度为500μg/m3，暴露时间为20分钟。
11、优选的，所述模型的气道高反应性表征为在乙酰甲胆碱激发后，气道阻力增强呼吸暂停值（penh）大于5.0。
12、优选的，所述模型的病理学特征包括支气管腔内黏液栓形成率大于50%，平滑肌厚度与基底膜周长的比值不小于0.12。
13、优选的，检测指标包括支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的分类计数，以及肺组织中il-4、il-5、il-13、il-17a、tnf-α的mrna或蛋白表达水平。
14、与现有技术相比，本申请的有益效果主要体现在以下几个方面：
15、首先，本申请采用过敏原、病原微生物和pm2.5三重因素的联合诱导方式，而不仅是单一或双因素组合。对比实验结果表明，传统的ova单独模型主要表现为典型th2炎症反应，ova+af或ova+pm2.5模型虽可出现一定程度的中性粒细胞炎症或气道黏液分泌，但炎症类型不完整、气道重塑不充分，且持续时间有限。而本发明的三因素联合模型能够稳定诱导出th2/th17混合炎症、嗜酸性粒细胞与中性粒细胞双重浸润、气道黏液栓形成率超过50%以及平滑肌显著增厚等综合病理学表型，呈现出质的差异，而非量的叠加。
16、其次，在药理学响应方面，本申请模型对糖皮质激素表现出明显的不敏感性。实验结果显示，地塞米松干预后，ova或双因素模型中il-17a和tnf-α表达水平下降幅度超过40%，而三因素模型中下降幅度不足20%，提示该模型能够再现临床上类固醇抵抗型哮喘的典型特征。这是现有单因素或双因素模型均无法稳定获得的。
17、再次，本发明模型的稳定性与可重复性显著提高。统计显示，实施例中的三因素联合造模小鼠中95%以上均出现一致的病理学和炎症学表型，而双因素模型中该比例仅约为40%～50%。因此，本发明不仅缩短了建模周期，而且能够在不同实验动物中获得一致且可控的重度哮喘表型。
18、最后，本发明模拟的诱因组合（过敏原暴露+呼吸道感染+空气污染）高度符合临床哮喘急性加重的真实情境，使得模型所得病理表型与人类疾病的相关性更强。该模型不仅有助于深入解析哮喘急性加重和类固醇抵抗的发病机制，还可广泛应用于新型抗炎药物、免疫调节剂及细胞治疗手段的药效学评价与疗效验证，为临床转化研究提供可靠平台。
1.一种联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述过敏原为卵清蛋白，其配制浓度为1～3%（w/v）的生理盐水溶液，或为屋尘螨提取物，以总蛋白计其配制浓度为0.3～3 mg/ml。
3.根据权利要求1所述的联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述病原微生物选自细菌、真菌或病毒中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述病原微生物选自铜绿假单胞菌、肺烟曲霉菌或呼吸道合胞病毒的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述病原微生物选自以下之一：
6.根据权利要求1所述的联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述pm2.5气溶胶的浓度为500μg/m3，暴露时间为20分钟。
7.根据权利要求1所述的联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述模型的气道高反应性表征为在乙酰甲胆碱激发后，气道阻力增强呼吸暂停值（penh）大于5.0。
8.根据权利要求1所述的联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，所述模型的病理学特征包括支气管腔内黏液栓形成率大于50%，平滑肌厚度与基底膜周长的比值不小于0.12。
9.根据权利要求1所述的联合诱导加重哮喘动物模型的构建方法，其特征在于，检测指标包括支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的分类计数，以及肺组织中il-4、il-5、il-13、il-17a、tnf-α的mrna或蛋白表达水平。