专利名称：有机磷化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过透化细胞膜使药物和营养素生物利用度改善的有机磷化合物。更具体地说所述化合物可以类似溶血磷脂(nanoencapsulation)和磷脂的方式用作动物饲料添加剂以提高营养素摄取、改善水产物的色素吸收并用于供体内药物释放的药物超微包封。在David Garnett和Robin Jones发表的《基因工程师和生物工艺学家》(The Genetic Engineer and Biotechnologist),13卷，第2期，1993和国际申请WO94/22324中提出该生物利用度改善的一种机理。
上述类型的化合物通过将天然化合物提纯而得到，因此基本不纯。所以当与磷脂相比时，需要高纯度化合物(例如可从化学合成得到)，以提高化合物的热稳定性和抗酶作用性。
本发明所述有机磷化合物为磷脂，该磷脂优选通过长链烷基酰氯与优选含有活性羟基或氨基的有机膦酸衍生物反应而制得。
本发明一方面提供具有下式的有机膦酸化合物
其中，n=0或1
R3=含有＞10个碳原子的烷基R4=H或CH3优选R4是甲基。
烷基酰氯具有10个或更多碳原子、并优选不超过约20个碳原子的链长，特别合适的为十六烷酸和十二烷酸的酰氯。
尤其合适的膦酸衍生物是乙烷-1-羟基-1,1-二膦酸(Etidronic acid)与1和2氨基-乙基膦酸。
因此，另一方面本发明提供了一种适合用作动物饲料添加剂、改善水产物色素吸收以及用于供体内药物释放的超微包封药物的本发明所述的有机磷化合物的制备方法，它包括将长链脂肪酸的酰氯与含有活泼氨基或羟基的烷基膦酸衍生物在非水介质(优选氯仿)中和低温下进行反应、用冷水洗涤并随后进行干燥。
优选反应温度保持在低于5℃并更优选3-5℃。
同时优选反应物按化学计量比使用。
本发明还提供了上述用作动物饲料添加剂、改善水产物的色素吸收或用于供体内药物释放的药物超微包封的有机磷酸。
本发明的又一方面是提供能够用作动物饲料添加剂并通过乙烷-1-羟基-1,1-二膦酸在非水介质中及低于5℃的温度下与十六烷酰氯反应制得的本发明有机磷化合物。
本发明的另一方面是提供一种适用于体内药物释放的药物超微包封的本发明有机膦酸衍生物的生产方法，该方法是将1或2-氨基乙基膦酸和十六烷基酰氯在非水介质中和低于5℃的温度下进行反应。
下列实施例说明但不限制本发明。
实施例1乙烷-1-十六烷酰基-1,1-二膦酸的制备从装有搅拌器的5L三口玻璃反应瓶的一口加入206g Etidonic酸(乙烷-1-羟基-1,1-二膦酸)于1L氯仿中的溶液，并使该溶液冷却至3-5℃。将温度保持在3-5℃的同时，在剧烈搅拌下从反应瓶的另一口加入275g十六烷酰氯。将反应放出的盐酸经第三口导出并使其通过氢氧化钠涤气器。全部十六烷酰氯加毕后，继续搅拌60分钟。反应完毕时将反应瓶中的内容物倾入冷水中，分离除去氯仿和未反应的以十六烷羧酸(一种蜡)形式存在的十六烷酰氯。进一步用冷水洗涤所得产物以去除痕量的未反应的Etidonic酸。产物经反复洗涤后过滤并在真空下干燥。
产物的收率为理论值的90％。
产物在约70℃下可溶于水并得到pH为10.5的溶液，同时通过附
图1所示的近红外(NIR)光谱(用NIR系统系列5000分光计测得)定性。可确信产物具有如下结构
乙烷-1-十六烷酰基-1,1-二膦酸对于鱼类色素摄取的影响将在下面实施例9中描述。
实施例2用125g2-氨基-乙基膦酸来替代Etidonic酸重复实施例1所述方法。
产物收率为理论值的90％。产物在60℃下溶解在水中从而得到pH为3.33的溶液。
产物具有如附图2所示的NIR光谱并被肯定具有如下结构
实施例3以1-氨基乙基膦酸代替2-氨基乙基膦酸重复实施例2。产物收率为60％并且具有如附图3所示的NIR光谱。产物在60℃下溶解在水中得到pH为3.76的溶液并确信具有如下所示结构
实施例4以219g十二烷酰氯代替十六烷酰氯重复实施例1。
产物收率为理论值的23.2％，并且产物在60℃下溶解在水中得到pH为10.42的溶液。产物通过如附图4所示的NIR光谱定性并确信具有如下所示结构
实施例5以219g十二烷酰氯代替十六烷酰氯重复实施例3。产物收率为理论值的20％。
确信产物具有如下所示结构
用辛酰氯代替十六烷酰氯和Etidronic酸或2-氨基乙基膦酸反应并不生成任何有价值的产物。
实施例1所得产物对BHK细胞菊粉摄取的体外作用如下面的实施例7所示。
实施例61-十六烷酰氨基乙基膦酸的制备制备分三步进行。步骤1将硫脲(9.89g,130mmol)加至乙醛(18.57ml,325mmol)和亚磷酸三苯酯(68.13ml,325mmol)的乙酸(130ml)溶液中，搅拌所得溶液，且在80℃下加热1小时得到橙色溶液。加入乙酸酐(325ml)并将所得溶液回流2小时，得到暗棕色溶液。然后经冷凝器小心滴加37％的氢溴酸水溶液(325ml)，并将所得溶液回流8小时，然后冷却并旋转蒸发。将深色残余物溶解在乙醇(260ml)中，并缓慢加入甲基环氧乙烷直至pH为6。该加料使如下所列反应产物的氨基膦酸A迅速沉淀出来。使固体沉降并滗去上层液体。加入新制乙醇(250ml)并将混合物短暂回流，然后冷却并滗除乙醇。重复这样的洗涤直至将大部分棕色脱去。最后将固体在高真空下干燥，得到轻微带色固体氨基膦酸A(8.23g,50.6％)，熔点＜290℃(分解)。
步骤2将氨基磷酸A(8.23g,65.8mmol)和六甲基二硅氮烷(55.5ml,263mmol)的混合物在150-160℃的油浴上加热直至所有固体溶解(2-5小时)。蒸除过量六甲基二硅氮烷并将残余物蒸馏，得到无色油状并且在15mmHg下沸点为140的N,O,O-三甲硅烷基衍生物B(17.50g,86％)，该产物的结构如下列反应式中所示
步骤3将十六烷酸(13.18g,51.4mmol)于无水乙酸乙酯(80ml)中的溶液在-5℃下搅拌，随后依次用三乙胺(17.15ml,5.4mmol)和氯甲酸乙酯(5.57g,51.4mmol)处理，后一组分为滴加。所得混浊混合物在-5℃搅拌0.5小时，然后滴加三甲硅烷基衍生物B于乙酸乙酯(35ml)中的溶液，并在相同温度搅拌所得混合物2小时，然后在不冷却情况下搅拌2小时，最后在80℃搅拌3小时。通过旋转蒸发从冷却混合物中除去挥发物。将残余物溶解在饱和碳酸氢钠水溶液中，将所得溶液用10％盐酸酸化至pH为2，并滤出沉淀的酰基氨基酸C。固体粗产物用甲醇洗涤以除去残余十六烷酸，然后在高度真空下干燥，得到白色固体1-十六烷酰氨基乙基膦酸C(16.0g,86％)。
所得的溶血磷脂的NMR谱图如附图5所示。
实施例7以常规方法并利用补加有10％FBS(Sigma F2442)、10ml/L的200mM L-谷氨酰胺(Sigma G7513)、5％TSB(Sigma T8159)和10ml/L抗生素/抗菌剂溶液(Sigma A9909)的G-MEM(SigmaG5154)培养BHK21(克隆13)细胞。在37℃和5％CO2下进行细胞培养。上述细胞系是来自位于Porton Down的应用微生物和研究中心的欧洲动物细胞培养物保藏中心。
将上述细胞在24孔平板(Sigma M9655)中进行培养。所有试验重复三次。
将孔内细胞暴露在从75μCi储备液、在Hanks平衡盐溶液(SigmaH9394)中制备的1μCi的C14菊粉下。这些细胞还同时暴露于不同浓度的实施例1产物下。培养1小时后抽去介质。将附着细胞随后用Hanks氏溶液洗涤两次并再用胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma T5775)对细胞进行胰酶消化，在1000rpm下和预先称重的Eppendorf管内将细胞离心成片状沉淀物。然后用蒸馏水裂解细胞片状沉淀物。再次离心Eppendorf管然后转移出等份蒸馏水(100μ)，与Sigma氟闪烁混合液(SigmaFluor Scintillation cocktail)(Sigma S4398)混合并利用闪烁计数器读数。在将Eppendorfs再次称重后将结果换算为DPM/mg细胞重量。
所得结果绘制为附图6所示的图并清楚显示出一种双相响应，其中，在很低浓度下菊粉进入细胞的通量减小，但在较高剂量下该通量显著地增加，同时菊粉为一种较大的化合物并且不是很典型的可被期望被优先吸收的化合物。其他大小的分子也可观测到相同的作用。
从卵磷脂制剂乳化能力的测定可得出有关磷脂和磷脂混合物的乳液形成特性的结论。一种用于测定超过24小时后仍稳定的水包油乳液百分量的经验方法如下所述取100ml蒸馏水和植物油置于烧杯中。加入卵磷脂试验样品(通常为1g)。在25℃下利用高速旋转混合器均化混合物1分钟。立刻将内容物全部转移到计量瓶中并在25℃下放置24小时。24小时后计算保持为油-水乳液的百分量。
将卵磷脂与90％卵磷脂-10％实施例1产物相比较进行测定得到下列结果空白对照(Conto1):0.0010卵磷脂0.1948
90％卵磷脂-10％实施例1的产物0.222上述结果表明乳化能力改善了12.3％。
所形成的包含实施例2产物在内的油-水混合物(Miscelle)的稳定性改善将在下面实施例8中描述。实施例8按下列方法制备脂质体通过Utra-TurrexT25均化器在14,000rpm下约30秒的均化作用来制备实施例2产物的1％水分散体。制备两套脂质体，在制剂中，第一种待测样品是由纯磷脂酰胆碱(卵磷脂)形成，而第二种是用10％的实施例2产物制得。利用Cecil Series2仪在500NM波长下分光光度测定脂质体浓度。脂质体制剂用显微镜检测以进行分光光度计的校准。将油-水混合物(miscelle)制剂用水浴在30加热10分钟和3小时以及在60℃下加热30分钟。分析结果如下10分钟 3小时 60℃-30分钟卵磷脂 1.311.2880.975卵磷脂+10％实1.341.3381.062施例2产物净增值 0.022％ 3.88％ 8.92％上述结果表明，在本发明所制磷脂的存在下油-水混合物在高温的稳定性显著增加。
实施例9乙烷-1-十六烷酰基-1,1-二膦酸(Corbinol)对鲑鱼色素摄取的影响本试验采用350条由纯Mowi杂交性种而来的、经饲养达到24月龄并且平均起始体重为1.2Kg的初次由河入大西洋的大西洋鲑鱼。
所用的5种处理设备详述如下A-四个相邻的5m试验箱
B-一个12m繁殖箱(海水浴空白对照)AB直径5.0m12.0m箱壁高度1.2m1.8m水深0.9m1.6m容量17.6m 180.0m构建将水泥箱嵌造在平面地基上并且内涂层平滑。进水口A位于箱表面单根100mm的使入水方向环绕箱体边缘的进水口。水流用蝶形阀控制-最大流量为每分钟2000L。
B位于箱表面单根200mm的使入水方向环绕箱体边缘的进水口。水流用滑动阀控制-最大流量为每分钟2000L。出水口A位于箱底中部并与150mm长的出水管相连的0.6m×0.6m直径的平面筛。
B位于箱底中部并与200mm长的出水桶相连的0.5m×0.8m直径的平面筛。水源A用以一个11kw离心泵(带备用)自主盐水总箱中将水引入箱体进水口。总箱通过两个独立的抽水的最低深度为低于表面3m泵系统供水。盐浓度为27ppt-31ppt。水在进入泵之前用15mm的栅条过筛。水通过箱体一次(不再循环)并且保留时间少于1小时。
B箱体直接从主盐水总箱内进水。通气各箱通过各自的空气扩散器从大的农用鼓风机中提供空气。
这样可有效提高常规条件下的氧水平并将在供水失败的故障情况下使鱼继续存活数小时。水位控制A位于与箱体相邻的共享排放池内的外固定管。
B外固定管。跳网(jump netting)沿着箱体四周和捕食线设置200mm高的85％遮盖网(shade netting)。系统失败指示在各箱体内安装低水位浮体开关。与中心警报器连接并全天24小时监视。自动喂食各箱都安装一个可悬浮在箱体边缘水面上方的3kg容量的定时喂食机。
每天通过人工并用自动喂食机作为补充来对鱼进行3次喂食。大约50％根据标准商品饲养表计算的全天摄食量由人工提供。为增加鱼的体重，以每周计，可对喂食速率进行适当调整。
将死亡的鱼立刻取出并记录它们各自的体重和确定的死因。在试验过程中任何被认为是必需的疾病治疗应在所有鱼箱中进行，以减小由于治疗可能造成的箱之间的差异。
保持经过箱体的水流以确保最低溶氧水平为7.0mg/L。每天检测氧的含量，并且如果需要可将调节水流以保持鱼箱间平衡。定期刷洗鱼箱以防止废物堆积和过多的的悬浮固体。
每天记录水温。
采用下列方法来称重鱼关闭进入箱体的水流并使水深降至20cm。利用安装在箱体内的扩散器来维持氧含量。然后将麻醉剂(溶解在甲基化酒精中的对氨基苯甲酸乙酯)加入到水中使鱼镇静。用网将鱼捞至容积为40L并装有15L水的吊桶内，成批地用Salter 50kg悬式弹簧称称重。这样应激水平和物理伤害都保持在最低限。
鱼的食物如下食物A-55ppm虾黄质食物B-55ppm虾黄质+Corbinol(乙烷-1-十六烷酰基-1,1-二膦酸)食物C-标准Trouw 75ppm虾黄质(空白对照)。
将350条鱼平分到5个箱内(每箱70条)。箱1和3用食物A喂食；箱2和4用食物B喂食(都是A型箱)；海水箱用食物C喂食(B型箱)鱼食的丸粒大小是6.5cm。
该试验进行36天。
在试验开始和试验结束时称量各箱中鱼的总重量。4周后进行尸体分析的鱼样品的采样。在下列时间进行采样试验开始时取10条鱼作为基值4周后从各箱内取10条鱼；在36天的时间结束时取所有成活的鱼作样品。
经挑选后立即利用HPLC分析样品的虾黄质水平。
第4周后进行分析，第1组显示出最大范围的色素形成，因此从组1中选出更多的鱼用HPLC进行分析。取25％的鱼进行HPLC测定而所有鱼进行Roche Fan分值确定。
表1列出通过试验记录的统计量。
附图7代表用三种食物的每一种喂养的鱼在试验结束时的重量的图示。
附图8代表用三种食物的每一种喂养的鱼在试验结束时的RocheFan分值的图示。
附图7和8所示结果用标准求导(derivation)方法计算，并得出与以空白对照食物喂养的鱼数目相比以食物A和B喂养的鱼数量的差异。
附图7表明用营养素(虾黄质)和有机-磷化合物(Corbinol)共同饲养的鱼比用不含有机磷化合物食物喂养的鱼的重量有更大的增加。
附图8表示用营养素(虾黄质)和有机-磷化合物(Corbinol)共同饲养的鱼比用不含有机磷化合物食物喂养的鱼表现出更高的Roche Fan分值。
表1实施例9的试验统计量箱 1 2 3 4 海水浴食物 A B A B C起始日期 27.2.95结束日期 4.4.95天数 36 36 36 36 36起始数量 70 70 70 70 70死亡数量 0 0 0 0 0结束时数量 70 70 70 70 70起始总重量 80.484.782.886.568.6结束时总重量 97.599.596.1106.2 86.1死亡的重量 0 0 0 0 0重量增加 17.114.813.319.717.5起始平均重量 1.149 1.210 1.183 1.236 0.980结束时平均重量 1.393 1.421 1.373 1.517 1.230％增值 21.317.516.122.825.5比生长率(％天) 0.540.450.410 0.570.63消耗的食物kgs15.814.215.518.00食物转化率 0.920.961.170.910平均温度 7.9食物A Trouw65,55ppm虾黄质B Trouw 65,55ppm虾黄质+corbinolC空白Trouw65,75ppm虾黄质食物由Trouw直接提供。
Corhinol(乙烷-1-十六烷酰基-1,1-二膦酸)
权利要求
1．具有下式的有机膦酸化合物
其中n=0或1
R3=含有＞10个碳原子的烷基R4=H或CH3
2．权利要求1中的有机膦酸化合物，其中R4为甲基。
3．权利要求2中的有机膦酸，它具有下式
4．权利要求2中的有机膦酸，它具有下式
5．权利要求2中的有机膦酸，它具有下式
6．权利要求1中的有机膦酸，它具有下式
7．权利要求2中的有机膦酸，它具有下式
8．一种制备权利要求1所述的有机膦酸化合物的方法，包括在非水介质中和低温下使长链脂肪酸的酰氯与含有活泼氨基或羟基的烷基膦酸衍生物进行反应、用水洗涤并干燥。
9．权利要求8中的制备有机膦酸化合物的方法，其中非水介质为氯仿。
10．权利要求8或9中的制备有机膦酸化合物的方法，其中温度保持在5℃以下。
11．权利要求10中的制备有机膦酸化合物的方法，其中温度范围为3-5℃。
12．权利要求8-11中任一项的制备有机膦酸化合物的方法，其中所述的长链脂肪酸酰氯的链中含有少于20个碳原子。
13．权利要求12中的制备有机膦酸化合物的方法，其中酰氯为十六烷酰氯或十二烷酰氯。
14．权利要求8-13中任一项的制备有机膦酸化合物的方法，其中膦酸衍生物是乙烷-1-羟基-1,1-二膦酸(Etidonic acid)或者1或2-氨基乙基膦酸。
15．权利要求8-14中任一项的制备有机膦酸化合物的方法，其中反应试剂按化学计量比使用。
16．权利要求1-7中任一项的有机膦酸化合物，它用作动物食物添加剂、改善水产物的色素摄取或用于体内药物释放的药物超微包封。
全文摘要
本发明公开了具有式(Ⅰ)的有机膦酸,其中:n=0或1;R
文档编号A23K1/16GK1218477SQ9719452
公开日1999年6月2日 申请日期1997年4月14日 优先权日1996年4月12日
发明者D·J·加尼特 申请人:洛夫斯格罗夫研究有限公司