非动物源性防冻液及其对食蟹猴精液的冷冻保存方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物繁殖技术领域，具体是一种非动物源性防冻液及其对食蟹猴精液的冷冻保存方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]虽然很多动物的精子都能够被成功冷冻保存，但相当一部分精子会因冷冻复苏过程中受到的损伤而丧失其运动能力。对大多数动物而言，即使采用最先进的仪器设备和最佳冷冻程序，也仅有约50%的精子能够存活下来。精子冷冻的效率之所以这么低，主要是因为人们对精子冷冻损伤的机制及某些具有冷冻保护作用物质的作用机理缺乏了解所致。
[0004]在大多数动物精子冷冻保存中，防冻液中除甘油外一般还加入一些动物源性物质如卵黄、脱脂奶、牛奶等，有的甚至加入血清。由于这些动物源性物质成分复杂且含有许多化学成分不确定的分子，这就使得在分析某种物质对精子冷冻起何作用的时候极为困难。此外，卵黄等动物源性物质不仅可能会含有一些致病性因子，如病毒、细菌、真菌、朊蛋白等，而且对它们的质控也不容易。
[0005]鉴于以上这些原因，成分确定的稀释液有助于人们更好地理解精子低温冷冻损伤的机制以及某些物质的冷冻保护机理。
[0006]卵黄、脱脂奶等动物源性物质在动物精液冷冻中主要起着抗冷休克、提高冷冻精液存活率的作用，用非动物源性防冻液冻存的精子其存活率通常远远低于40%，不能用于进行体外受精或人工受精。以前的研究表明，小鼠、山羊和人精子可成功冻存于化学成分确定的非动物源性防冻液中，但类似技术在灵长类动物精子冷冻中还未见报道。
[0007]
【发明内容】
[0008]本发明的目的是为了杜绝体外受精或人工受精系统中引入致病性因子的风险，更好地理解精子低温冷冻损伤机制以及冷冻保护机理，对防冻液的质控易于进行，提供一种非动物源性防冻液及其对食蟹猴精液的冷冻保存方法，使食蟹猴精液冷冻复苏后精子存活率超过40%，用于相关的科研及动物繁殖工作。
[0009]本发明所采取的技术方案如下:
一种非动物源性防冻液及其对食蟹猴精液的冷冻保存方法，步骤如下:
(1)取0.2gTrisU.2g TES、2g乳糖、2g葡萄糖、0.2g棉籽糖、10000IU青霉素G钠盐和5mg硫酸链霉素，依次溶于80mL Mill1-Q超纯水中，混合均匀后加Mill1-Q超纯水定容至10mL,用IN NaOH或IN HCl调节pH至7.0-7.2，制成稀释液；
(2)取18mL稀释液，加入2mL的甘油制成2X防冻液；
(3)在室温下，将食蟹猴精液与所述稀释液按1:9的体积比在试管中混合并放置I小时，得稀释精液； (4)室温下，所得稀释精液中加入等体积的、含甘油的2X防冻液，混匀后于室温平衡30分钟得防冻精液；
(5)将防冻精液吸入0.25 mL冷冻麦管并封口，然后将麦管转入4°C冰箱缓慢降温45分钟；
(6)将降温后的麦管置于液氮面上方5cm处熏蒸冷冻10分钟后投入液氮中保存；
(5)复苏时将冷冻麦管由液氮中迅速转移至37°C的水浴中解冻2分钟。
[0010]所述的室温为20-23°C。
[0011]所述2X防冻液分五次加入试管，每次间隔5分钟加入1/5体积，甘油的终浓度为5%。
[0012]所述Tris和TES分别为三羟甲基氨基甲烷和N-三(羟甲基)甲基_2_氨基乙烷磺酸钠的英文缩写。
[0013]本发明的优点是:
本发明杜绝了体外受精或人工受精系统中引入致病性因子的风险，便于更好地理解精子低温冷冻损伤机制以及冷冻保护机理，对防冻液的质控也易于进行。利用本发明的非动物源性防冻液可使食蟹猴精液冷冻复苏后精子的存活率超过40%，可用于相关的科研及动物繁殖工作，同时为用非动物源性防冻液冷冻保存其他灵长类动物的精子提供借鉴作用。
[0014]
【具体实施方式】
[0015]以下通过实施例对本发明做进一步描述。
[0016]实施例:
称取0.2g TrisU.2g TES、2g乳糖、2g葡萄糖、0.2g棉籽糖、10000IU青霉素、5mg硫酸链霉素依次溶于80mL Mill1-Q超纯水中，混合均匀后加Mill1-Q超纯水定容至10mL,用IN NaOH或IN HCl调节pH至7.0-7.2，制成冷冻保存稀释液。向精液稀释液中加入体积比10%的甘油制成精液冷冻保存的2X防冻液。在室温条件下20-23°C，将食蟹猴的精液与稀释液按1:9的体积比在4mL的试管中混合并放置I小时。然后，在室温下向试管中加入等体积的、含甘油的2X防冻液，分五次添加，每次加入1/5体积，每次间隔5分钟，甘油的终浓度为5%，混匀后于室温平衡30分钟。接着，将所得精液吸入0.25 mL冷冻麦管并封口，然后将麦管转入4°C冰箱缓慢降温45分钟。将麦管置于液氮面上方5cm处熏蒸冷冻10分钟后投入液氮中保存。复苏时将冷冻麦管由液氮中迅速转移至37°C的水浴中解冻2分钟。
[0017]对冷冻保存的食蟹猴精液，在显微镜下检测冷冻复苏后精子的运动度、运动度复苏率，精子运动度复苏率的记算:以Mpr代表冷冻前精子的运动度，Mps代表复苏精子运动度，则精子运动度的复苏率(％)=Mps/Mpr X 100%。用荧光染料Hoechst 33258荧光染色法实验测定冷冻精子复苏后的质膜完整率，其结果表明:冷冻复苏精子运动度为43%，运动度复苏率为56%，精子质膜完整率为50%。
[0018]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种非动物源性防冻液及其对食蟹猴精液的冷冻保存方法，其特征在于，步骤如下: (1)取0.2gTrisU.2g TES、2g乳糖、2g葡萄糖、0.2g棉籽糖、10000IU青霉素G钠盐和5mg硫酸链霉素，依次溶于80mL Mill1-Q超纯水中，混合均匀后加Mill1-Q超纯水定容至10mL,用IN NaOH或IN HCl调节pH至7.0-7.2，制成稀释液； (2)取18mL稀释液，加入2mL的甘油制成2X防冻液； (3)在室温下，将食蟹猴精液与所述稀释液按1:9的体积比在试管中混合并放置I小时，得稀释精液； (4)室温下，所得稀释精液中加入等体积的、含甘油的2X防冻液，混匀后于室温平衡30分钟得防冻精液； (5)将防冻精液吸入0.25 mL冷冻麦管并封口，然后将麦管转入4°C冰箱缓慢降温45分钟； (6)将降温后的麦管置于液氮面上方5cm处熏蒸冷冻10分钟后投入液氮中保存； (5)复苏时将冷冻麦管由液氮中迅速转移至37°C的水浴中解冻2分钟。
2.根据权利要求1所述的一种非动物源性防冻液对食蟹猴精液的冷冻保存方法，其特征在于，所述室温为20-23°C。
3.根据权利要求1所述的一种非动物源性防冻液对食蟹猴精液的冷冻保存方法，其特征在于，步骤(2)所述的2X防冻液分五次加入试管，每次间隔5分钟加入1/5体积，甘油的终浓度为5%。
【专利摘要】本发明公开了一种非动物源性防冻液及其对食蟹猴精液的冷冻保存方法，该防冻液由0.2g Tris、1.2g TES、2g 乳糖、2g 葡萄糖、0.2g 棉籽糖、10000IU 青霉素G钠盐、5mg硫酸链霉素依次溶于80mL Milli-Q 超纯水中，混合均匀后加Milli-Q 超纯水定容至100mL，用1N NaOH 或1N HCl调节pH至7.0-7.2，制成稀释液，再取稀释液，加入甘油制成2×防冻液；本发明杜绝了体外受精或人工受精系统中引入致病性因子的风险，便于更好地理解精子低温冷冻损伤机制以及冷冻保护机理，对防冻液的质控也易于进行。
【IPC分类】A01N1-02
【公开号】CN104521944
【申请号】CN201410847275
【发明人】李亚辉, 杨明华
【申请人】云南农业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月31日