一种精液冷冻保存液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物体液保存技术领域，具体的说涉及一种精液冷冻保存液及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 由于家畜繁殖生产中生物安全性也开始逐渐受到人们的关注，许多研究者对精液 冷冻添加卵黄、牛奶等动物源成份提出异议，认为可能带来微生物污染并存在生物安全性， 故以植物源的有效成份替代动物源成份已成为当前精子冷冻保存技术的一个研究热点，也 是精子冷冻保存液实现商业化、标准化生产的一个积极推动因素。
[0003] 大豆卵磷脂（Soylecithin)是从大豆中提取的一种两性表面活性的磷脂类物 质，与鸡蛋卵黄中具有抗低温打击保护能力的主要功能性成分类似，也不存在生物安全性 问题。故大豆卵磷脂在精液冷冻中应用代替卵黄等成份受到许多研究者的关注。在最近十 年里，国内外研究者将大豆卵磷脂在牛、马、羊和猪等家畜精子冷冻上进行了大量试验，证 实大豆卵磷脂对家畜精子的抗低温打击保护能力与鸡蛋卵黄接近或相当。然而，由于常规 加热、超声波等常规辅助促溶手段的局限性，导致大豆卵磷脂添加浓度较低，且溶液呈悬浊 液、粒径较大（15. 25 ±9. 744iim)，久置会造成沉淀。
[0004] 而研究已证实，冷冻保存液中存在不规则大颗粒是对精子冷冻效果不利的重要因 素之一。一方面，精液冷冻保存液中存在较多不规则的大颗粒，在冷冻过程中使溶液中水分 子更容易生成不规则大冰晶，可造成对精子细胞不可逆的机械性损伤；另一方面，较大粒径 的大豆卵磷脂也不利于其附着在精子膜表面发挥保护作用。
[0005] 纳米技术是一门制备和研究结构尺寸在0. 1?IOOnm材料的技术。由于量子尺寸 效应和表面效应的缘故，纳米材料会表现新的物理和化学特性。其中，高能球磨机、高压均 质机等纳米化手段已开始应用于中草药处理，大大促进了传统中药走向现代化。高压均质 法为第二代纳米均质技术，可将以液体为载体的固体颗粒送入工作阀，在低温（0?KTC)、 高压条件下，产生强烈的剪切、撞击、空穴和湍流蜗旋作用，从而使溶液中固体颗粒得到超 微细化，能大幅度地提高药物溶解性和生物利用度。而对大豆卵磷脂溶液进行纳米化处理 还末见有相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明首先提供了一种精液冷冻保存液，其含有大豆卵磷脂，其中大豆卵磷脂的 粒径为133±22nm。
[0007] 具体的说，本发明的一种精液冷冻保存液，其由如下组分组成：
[0008] 大豆卵磷脂以及基础冷冻液；
[0009] 其中大豆卵磷脂的粒径为133±22nm，大豆卵磷脂在基础冷冻液中的添加浓度为 2?15% (为质量百分比浓度，优选的浓度为3%、6%、9%、12%和15% );
[0010] 其中基础冷冻液为TCG基础冷冻液；
[0011] 本发明还提供了制备上述精液冷冻保存液的方法，该方法为：
[0012] 将大豆卵磷脂溶于基础冷冻液，然后进行纳米化处理。
[0013] 其中进行纳米化处理是利用高压均质机进行，处理工艺为：4?KTC条件下，压强 1500 ?2000bar。
[0014] 本发明的精液冷冻保存液经高压均质处理，大幅度降低大豆卵磷脂的粒径，提高 其溶解性并增加溶液的稳定性，从而更好发挥其对猪精子的冷冻保护作用。大豆卵磷脂精 液冷冻保存液溶液稳定、呈清澈透亮，久置无沉淀产生，利于标准化生产。
【附图说明】
[0015] 图1-a实施例2中常规方法制备的大豆卵磷脂冷冻保存液I液的粒径分布范围 [0016] 图l_b实施例2中常规方法制备的大豆卵磷脂冷冻保存液I液的粒径颗粒数比例
[0017] 图2-a实施例1中大豆卵磷脂（6% )冷冻保存液I液的粒径分布范围
[0018] 图2-b实施例1中大豆卵磷脂（6% )冷冻保存液I液的粒径颗粒数比例
【具体实施方式】
[0019] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0020] 实施例1大豆卵磷脂精液冷冻保存液的配制
[0021] 基础冷冻保存液的配制：
[0022] TCG基础冷冻液：葡萄糖I.lg，柠檬酸I. 48g，Tris2. 42g，加蒸馏水至IOOmL,调 pH至 6. 21 ;
[0023] 将大豆卵磷脂（Sigma公司产品，货号：P5638)溶于TCG基础冷冻液（50?60°C) 中，大豆卵磷脂的添加浓度分别为2%、3%、6(%、9(%、12 (%和15(%，并充分搅拌然后做超声 波处理；
[0024] 采用高压均质机（广州聚能生物科技有限公司，JN-02C)对大豆卵磷脂冷冻保存 液进行纳米化处理，相关参数为4?KTC条件下，压强1500?2500bar，反复处理三次。溶 液置于试管密封4°C保存备用。
[0025] 利用激光粒度仪（BeckmanCoulterLS230,美国）测定大豆卵磷脂粒径范围，为 133±22nm，具体见图 2-a和 2-b。
[0026] 实施例2
[0027] 2. 1猪精液采集：
[0028] 精液样品来自1. 5?2岁、体格健壮、繁殖性能良好的8头上海白猪种公猪。精液 采集采用手握法，收集中段精子浓厚部分精液，专用滤纸除去胶状物，显微镜初检，合格精 液用保温瓶运回实验室。
[0029] 2. 2相关溶液的配制
[0030] 鸡蛋卵黄冷冻保存液I液：80% (体积分数）TCG基础冷冻液添加20 % (体积分 数）鸡蛋卵黄，磁力搅拌器充分搅拌均匀，经离心、取上清过滤处理，备用；
[0031] 常规方法制备的大豆卵磷脂冷冻保存液I液：TCG基础冷冻液中直接添加2%重 量百分比的大豆卵磷脂；
[0032] 实施例1中制备的大豆卵磷脂冷冻保存液I液：TCG基础冷冻液中加入6%重量百 分比的大豆卵磷脂后，按照实施例1的方法进行高压均质纳米化处理；
[0033] 鸡蛋卵黄冷冻保存液II液、常规方法制备的大豆卵磷脂冷冻保存液II液和实施例 1中制备的大豆卵磷脂冷冻保存液II液分别是在其相应的I液中添加9% (体积百分比） 的甘油；
[0034] FITC-PNA染液：0.OOlgFITC-PNA，溶于IOmLPBS中，用 0. 45iim滤膜过滤后，避 光贮存。
[0035] 果糖一柠檬酸钠低渗液：果糖0? 6756g、二水柠檬酸钠0? 3676g加蒸馏水至50mL。 2. 3猪精液的冷冻保存
[0036] 精液运至实验室后，用离心管等量分装，离心（800Xg，10min)、弃上清，力口 BTS(Beltsvillethawingsolution)液至原来体积，15层纱布包裹在17°C恒温箱平衡Ih, 将平衡处理过的精液用离心管分装、离心（800Xg，IOmin)，弃上清，分成三组，分别为"鸡蛋 卵黄组"、"常规方法组"和"实施例1组"，然后分别加鸡蛋卵黄冷冻保存液I液、常规方法制 备的大豆卵磷脂冷冻保存液I液和实施例1中制备的大豆卵磷脂冷冻保存液I液，置于 5°C冰箱中缓慢降温2h，再分别加鸡蛋卵黄冷冻保存液II液、常规方法制备的大豆卵磷脂冷 冻保存液II液和实施例1中制备的大豆卵磷脂冷冻保存液II液，甘油终浓度为3%，即BTS 精液与I液和II液的体积比为1:1:1。5°C冰箱平衡lh，装管（0.25mL)，置于程序冷冻仪中 以1°C/min的速率从5°C缓慢降至_5°C，迅速移至液氮上方3cm熏蒸15min，将细管投入液 氮。从液氮罐中取出保存2周的冷冻细管，投入37°C水中，20s解冻。
[0037] 2. 4猪精液品质指标检测
[0038] 2. 4. 1精子活率的检测
[0039]取各组细管冷冻精液于37°C，45s水浴解冻，解冻后37°C水浴5min，取10iiL精液 于精子品质分析仪专用计数池，压盖板排出计数池中多余精液，计数5个视野以上进行检 测精子活率（即直线运动精子百分数）。
[0040] 2. 4. 2精子顶体完整性检测
[0041] 采用FITC-PNA荧光染色法对猪精子顶体完整性进行检测。精子经FITC-PNA染色 后，因FITC-PNA可与精子顶体膜上的受体特异结合，在激发波长480nm、发射波长530nm紫 外光激发下可区分出四种不同类型的精子：
[0042] 1)顶体完整精子，顶体顶部发强光且边缘规则光滑；
[0043] 2)顶体部分破坏精子，顶体前区杂乱发光且边缘不规则；
[0044] 3)顶体前帽缺失的精子，仅在赤道区有荧光；
[0045] 4)顶体完全破坏精子，无荧光。每项每次计算至少200个精子。
[0046] 2. 4. 3精子质膜完整率检测
[0047] 将解冻后的精液用果糖一柠檬酸钠低渗液稀释，调整精子密度为2X106/mL，37°C 孵育30min后，取20yL精子悬液于血细胞计数板上，400X倒置显微镜下计算弯尾精子的 百分率，每次至少数200个精子。
[0048] 2. 5统计分析
[0049] 利用SPSS统计软件的t检验和方差分析进行数据处理。
[0050] 2. 6结果与分析
[0051]
【主权项】
1. 一种精液冷冻保存液，其特征在于其含有大豆卵磷脂，其中大豆卵磷脂的粒径为 133±22nm。
2. 根据权利要求1所述的精液冷冻保存液，其特征在于其由如下组分组成： 大豆卵磷脂以及基础冷冻液； 其中大豆卵磷脂在基础冷冻液中的添加浓度为2-15%。
3. -种制备权利要求1或2所述精液冷冻保存液的制备方法，其特征在于该方法为： 将大豆卵磷脂溶于基础冷冻液，然后进行纳米化处理。
4. 根据权利要求3所述的精液冷冻保存液的制备方法，其特征在于其中进行纳米化处 理是利用高压均质机进行，处理工艺为：4?10°C条件下，压强1500?2000bar。
【专利摘要】本发明公开了一种精液冷冻保存液，其含有大豆卵磷脂，其中大豆卵磷脂的粒径为133±22nm。本发明的精液冷冻保存液经高压均质纳米化处理，大幅度降低大豆卵磷脂的粒径，提高其溶解性并增加溶液的稳定性，从而更好发挥其对猪精子的冷冻保护作用。
【IPC分类】A01N1-02
【公开号】CN104604843
【申请号】CN201410849155
【发明人】张树山, 张德福, 戴建军, 吴彩凤
【申请人】上海市农业科学院, 上海申丰畜牧兽医科技有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年12月30日