一种橡胶草根段一步诱导成苗高效离体繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种橡胶草根段一步诱导高效离体繁殖方 法。
【背景技术】
[0002] 橡胶草（Rodin)为菊科（Compositae)蒲公英属多年生宿 根草本植物，外形与蒲公英非常相似，又被称为俄罗斯蒲公英，但其根部含有天然橡胶，在 我国俗称橡胶草。橡胶草中所含天然橡胶的结构和功能与巴西橡胶相似，且具有品质优良、 工业上利用价值高和含胶量高(橡胶草根部含天然橡胶达6%~28%)等特点，是极具经济发 展前途的产胶植物，在天然橡胶生产中具有十分重要的地位。
[0003] 橡胶草喜冷凉气候，适宜在较寒冷的生碱化草甸或沼泽地上生长。原产于前苏联 哈萨克共和国天山山谷和中国新疆的特克斯河流域。橡胶草离体培养获得高频再生不定芽 是建立橡胶草再生体系的重要环节，也是橡胶草基因转化和诱导多倍体优异新种质或新品 系的前提条件之一。在本研究中，以从俄罗斯引进的橡胶草种质资源作为试验材料，以根段 为外植体，通过器官发生的途径来诱导丛生芽，筛选出适合根段直接分化再生苗的最佳激 素浓度组合，试图建立橡胶草的高频再生体系，为进一步利用基因工程进行品种改良奠定 基础。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种橡胶草一步成苗快速繁殖的方法，它通过以橡胶草根段 为外植体，建立了一种通过器官发生的途径进行橡胶草的快速繁殖，该方法能够显著简化 育苗程序、缩短育苗周期、提高无性繁殖系数、降低变异频率、而且操作简便，是实现橡胶草 优质种苗工厂化生产的有效途径。同时，可为同类植物的一步成苗、增殖和生根一体化繁殖 提供技术依据。
[0005] 本发明所述的一种橡胶草根段一步成苗高效离体繁殖方法，包括以下步骤： ⑴根段诱导一步成苗：将橡胶草根段段接种到MS培养基中，在组培室内培养20~30 天得到无菌试管苗，其MS培养基中含NAA (萘乙酸）0~2.0 mg/L、6-BA (苄基氨基嘌呤） 0~1. 0 mg/L、琼脂4~7g/L、蔗糖30~40g/L。⑵试管苗丛生芽快速增殖培养：将步骤⑴ 中得到的无菌试管苗置于MS培养基中，在组培室内培养10~25天得到大量无菌试管苗， 其中MS增殖培养基中含ΝΑΑ0~3. 0 mg/L、6-BA (苄基氨基嘌呤）0~1. 0 mg/L、琼脂4~ 7g/L、蔗糖30~40g/L。⑶健壮植株生根培养：将步骤⑵中得到的健壮植株置于1/2MS生 根培养基中，在组培室内培养10~20天得到带根的完整植株，其中1/2MS生根培养基中 含IAA (吲哚乙酸）0~2. 5mg/L、IBA (吲哚丁酸）0~2. Omg/L、琼脂4~6g/L、蔗糖30~ 40g/L。⑷炼苗与移栽：步骤⑶获得带根的完整植株后，在室温下打开瓶盖，经过炼苗，表面 角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到基质中，在基质中生长20~30天后移 栽大田。
[0006] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤（1)中，所述培养基为：每升MS基 本培养基中添加 NAA 0~2· 0 mg、6-BA 0~L 0 mg、琼脂4~7g、鹿糖30~40g。
[0007] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤（1)中，采用生长20~30天根段为 外植体，直接进行无菌接种。
[0008] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤（2 )中，所述培养基为：每升MS基本 培养基中添加〇~3. 0 mg的NAA和0~1. 0 mg的6-BA，琼脂4~7g、鹿糖30~40g。
[0009] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤（3)中，所述培养基为：每升1/2MS 生根培养基中含IAA 0~2. 5mg，IBA 0~2. Omg，琼脂4~6g、鹿糖30~40g。
[0010] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤（3)中，簇生带根的再生苗直接或分 散为带有3~5个植株的丛苗形式进行移栽。
[0011] 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4)中，移栽基质采用泥炭土： 珍珠岩为1:1~3:1 (V/V)的混合基质。
[0012] 根据本发明所述方法的进一步特征，所述步骤（4)中，移栽后的培养液为自来水或 者1/4 MS培养液。
[0013] 本发明的突出优点和效果： 1、经实验证明，米用 MS+0 ~2. 0 mg/L ΝΑΑ+0 ~1. 0 mg/L 6-BA+30 ~40 g/L 鹿糖 +4~7g/L琼脂作为橡胶草根一步成苗的诱导培养基，外值体诱导为丛生芽的发生率达到 91. 2%，单个外值体平均成苗8~15株，组织培养苗生长良好，基本保持原种特性。
[0014] 2、经实验证明，在本发明所述方法中，采用橡胶草根段作为外植体，外植体的成活 率达到100%(污染率仅为2. 2%)，诱导率为88. 7%以上，外植体可以直接诱导并分化出多个 芽点。
[0015] 3、经实验证明，在本发明所述方法中，采用MS+0~3. 0 mg/L ΝΑΑ+0~1. 0 mg/ L6-BA+30~40 g/L蔗糖+4~7g/L琼脂作为橡胶草丛生芽的增殖培养基，增殖倍数最高可 达15. 3倍，试管苗生长旺盛，叶柄粗壮，叶片深绿色。
[0016] 4、经实验证明，在本发明所述方法中，采用1/2MS+0~2. 5mg/L ΙΑΑ+0~2. 0 mg/ L IBA+30~40 g/L蔗糖+4~7g/L琼脂作为橡胶草无菌苗的生根培养基，无菌苗的生根条 数为1. 〇~1. 2条，根长为8. 0~11. 9cm，生根率可达95. 0%以上，试管苗长势旺盛，叶片加 厚。
[0017] 5、经实验证明，在本发明所述方法中，经炼苗，簇生的组织培养苗可直接或分散移 栽到[泥炭土：珍珠岩=1:1~3:1 (V /V )]的混合基质中，30天后丛生苗的成活率达到 97. 1%，且生长旺盛。
[0018] 6、与现有的繁殖技术相比，本发明所述技术方法极显著简化了橡胶草育苗程序， 缩短育苗周期，提高无性繁殖系数，保持原种特性，培养程序简单，达到一次外植体诱导即 获得大量幼苗的效果，是实现橡胶草优质种苗工厂化生产的有效途径。
[0019] 7、本发明所述方法无需专有设备克服外植体的细菌污染对育苗造成的影响，操作 简便。
[0020] 综上所述，本发明以橡胶草根段为材料，研究不同生长调节剂组合配方对橡胶草 再生体系建立的影响，通过筛选培养基组分，优化培养条件，简化组织培养技术流程，探索 出不经过传统组织培养多环节交替接种程序的一步成苗快繁方法，建立了野生植物橡胶草 离体快繁的高效、简便、稳定的实用技术体系，达到一次接种则培育成健壮苗，并显著提高 无性繁殖系数，可直接应用于橡胶草商品种苗的工厂化生产。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明以橡胶草根为外植体进行组织培养快速繁殖方法的技术路线工序 流程图。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】进一步说明。
[0023] 如图1所示，橡胶草根段一步成苗高效离体繁殖方法工序包括以下步骤： ⑴橡胶草无菌试管苗的诱导：取生长健康带根的无菌橡胶草种苗，剪下根段，用灭过菌 的滤纸吸干水分，然后将根段剪成根段，将根段接种到MS培养基中。MS培养基中NAA浓度 为0~2. 0 mg/L，6-BA浓度为0~1. 0 mg/L，蔗糖和琼脂的浓度分别为30~40g/L和4~ 7g/L。培养20~30天时，每个外植体诱导为丛生芽的发生率达到91. 2%，单个外值体平均 成苗8~15株，组织培养苗生长良好，基本保持原种特性。
[0024] ⑵试管苗丛生芽快速增殖培养：将步骤⑴中得到的无菌试管苗置于MS培养基中 培养。MS增殖培养基中NAA浓度为0~3. Omg/L，6-BA浓度为0~1. Omg/L，蔗糖和琼脂的 浓度分别为30~40g/L和4~7g/L。培养10~25天时，苗高最高可达3. 9cm，增殖倍数 最高可达15. 3倍，试管苗长势旺盛，叶柄粗壮，叶片深绿色。
[0025] ⑶健壮植株生根培养：将步骤⑵中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中培 养。其中1/2MS生根培养基中IAA浓度为0~2. 5mg/L、IBA浓度为0~2. Omg/L、蔗糖和 琼脂的浓度分别为30~40g/L和4~6 g/L。培养10~20天时，根条数为1. 0~1. 2条， 根长可达8. 0~11. 9cm，生根率可达95. 0%以上，试管苗生长旺盛，叶柄粗壮，叶片加厚。
[0026] 齡|炼苗与移栽：步骤⑶获得带根的完整植株后，在室温下打开瓶盖，经过炼苗，表 面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到基质中，在基质中生长20~30天后 移栽大田。30天后再生苗的成活率达到97. 1%，且生长旺盛。
【主权项】
1. 一种橡胶草根段一步诱导成苗高效离体繁殖方法，其特征在于，包括如下步骤： ⑴橡胶草的根段诱导成苗：将橡胶草无菌根段接种到MS培养基中，在组培室内培养 20~30天得到无菌试管苗，其中MS培养基中含NAA 0~2. 0 mg/L、6-BA 0~1. 0 mg/L、琼脂4~7g/L、蔗糖30~40g/L ;⑵试管苗丛生芽快速增殖培养：将步骤⑴中得到的无菌试 管苗置于MS培养基中，在组培室内培养10~25天得到大量无菌试管苗，其中MS增殖培养 基中含 NAA 0 ~3. 0 mg/L、6_BA 0 ~1. 0 mg/L、琼脂 4 ~7g/L、鹿糖 30 ~40g/L ; ⑶健壮植株生根培养：将步骤⑵中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在组培 室内培养10~20天得到带根的完整植株，其中1/2MS生根培养基中含IAA 0~2. 5mg/L、 IBA 0 ~2. Omg/L、琼脂 4 ~6 g/L、鹿糖 30 ~40 g/L ; ⑷炼苗与移栽：步骤⑶获得带根的完整植株后，在室温下打开瓶盖，经过炼苗，表面角 质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到基质中，在基质中生长20~30天后移栽 大田。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述培养基为：每升MS 基本培养基中添加NAA 0~2.0 mg、6-BA 0~L0 mg、琼脂4~7 g、鹿糖30~40 g。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1)中，采用生长20~30天无 菌根为外植体，直接进行无菌接种。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2)中，所述培养基为：每升MS 基本培养基中添加NAA 0~3. 0 mg、6-BA 0~1. 0 mg、琼脂4. 5 g、鹿糖30~40 g。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)中，所述培养基为：每升 1/2MS生根培养基中含IAA 0~2. 5mg，IBA 0~2. Omg，琼脂4. 5g、蔗糖30~40g。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3)中，簇生的再生苗直接或分 散为带有3~5个植株的丛生苗形式进行移栽。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4)中，移栽基质采用泥炭土： 珍珠岩为1:1~3:1 (V/V)的混合基质。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4)中，移栽后的培养液为自来 水或者1/4 MS培养液。
【专利摘要】本发明涉及一种诱导产胶植物橡胶草根段一步成苗的快速繁殖方法，本发明说述的方法包括如下步骤：⑴将橡胶草根段置于MS培养基中诱导一步成苗；⑵将所述无菌试管苗置于MS增殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得健壮丛生芽或植株；⑶将所述健壮丛生芽或植株置于1/2MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；⑷取完整的带根苗进行炼苗后置于基质中生长一个月后移栽至大田。采用本发明所述方法得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量橡胶草的优质种苗。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105284617
【申请号】CN201510723035
【发明人】朱金霞, 张源沛, 郑国保, 孔德杰, 朱永兴, 吕学莲, 白海波
【申请人】宁夏农林科学院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年10月29日